توجيه مركب الريترومر لكل من مادة STxB وCD8-M6PR من الإندوسومات القديمة إلى الإندوسومات التي تم معالجتها، وتوجيه البروتين EHD1 لمادة STxB من الإندوسومات المُعالجة إلى شبكة جولجي.

توجيه مركب الريترومر لكل من مادة STxB  وCD8-M6PR من الإندوسومات القديمة إلى الإندوسومات التي تم معالجتها، وتوجيه البروتين EHD1 لمادة STxB من الإندوسومات المُعالجة إلى شبكة جولجي.

نبذة مختصرة
ينقل المرور المتأخر البروتينات، الدهون، السموم من غشاء البلازما إلى جسم جولجي والشبكة الإندوبلازمية.
ويجب أن تتوقف هذه الحمولات في النظام الإندوسومالي الذي يتكون من الإندوسومات المتأخرة والمُعالجة.
وتعبر كل هذه الحمولات من خلال الإندوسومات المتأخرة، لكن من الممكن أن تتخذ طرقاً مختلفة لأجسام جولجي.
وتمر هذه الحمولات المكونة من هذا التركيب البروتيني علي الإندوسومات المتأخرة إلى أن يصل إلي جسم جولجي.
وقد قارننا ماهية المنافسة علي جهاز بلع الخلايا لنوعين مختلفين من الشحنات المعتمدة علي المركبات البروتينية.
ويرتبط سم بكتيريا شيجا Shiga) toxin B) بالطبقة الخارجية لغشاء البلازما، والمستقبل مختلف الخلايا CD8-Mannose-6-Phosphate)) المثبت خلال الأغشية العابرة. ويخرج كلاهما للعبور خلال الجسيمات البالعة المدوِرة للخلايا. وقد حولت عملية استئصال هذه الخلايا المدورة كل هذه الشحنات إلى حجيرات غريبة ومنعتهم أيضاًمن الوصول لجسم جولجي. وفي حالة الجسيمات البالعة المدوِرة يتطلب سم Shiga(EHD1)لينتقل إلي TGN)) بينما في هذه الأثناء لا يتواجد أو يعتمد مستقبل ((CD8-Mannose-6-Phosphate بشكل كبير علي (EHD1)وبتحلل مكونات المتراكب البروتيني يسبب ترك المركبات المنقولة في أكلات الخلايا البدائية؛ بافتراض أن ذلك هو المخرج العكسي من هذه المنطقة. فهذا العمل يجعل الجسيمات البالعة المبدئية خطوة مطلوبة في الحركة الحيوية العكسية لهاتين الشحنتين الحاملتين لمتراكبات البروتينات Retromersعلي أقل تقدير. علي الجانب الأخر يرتبطEHD1 بالجسيمات البالعة المدورة لحركة (TGN) في (STxB).

مقدمة
تحدد الحمولات العكسية عملية نقل المواد من غشاء البلازما إلي جهاز جولجي والشبكة الإندوبلازمية بشكل واسع؛ وهي عملية تحدث في عكس اتجاه هذه الحمولات في ممرات الإفراز.
وتضمن هذه الحمولات العكسية سموم بكتيرية عديدة بالإضافة إلى الفيروسات وبروتينات الغشاء البلازمي. بالإضافة إلى ذلك فإن بعض البروتينات العابرة لجسم جولجي (TGN) ومن أمثلتها مركبي (TGN38), (Furin). هذه المركبات تسهل العملية الروتينية في خروج ودخول ال(TGN) من الغشاء البلازمي باستخدام هذا المسار.
ولكي تصل لل (TGN)؛ يجب أن تمر هذه العملية الداخلية العكسية خلال بعض تركيبات الجسيمات البالعة المبدئية، والمتأخرة، ومن المحتمل أيضًا أن تمر خلال الجسيمات البالعة المدوٍرة.
وتقدم مقالة حديثة تناولت هذه المسارات احتمالية سير هذه العملية إما مباشرة من ال (EE) إلي ال (TGN) أو تسير خلال الجسيمات البالعة المدوٍرة. وعلى الرغم من ذلك تظل متطلبات أو درجة العبور خلال أكلات الخلايا المدوٍرة غير معروفة.
ومن الواضح أن المسار خلال النظام الأكل للخلايا يختلف بناءً على اختلاف البروتين.
فعلى سبيل المثال: الفيورين وهو إنزيم محلل لبروتينات ال TGN))، فهو يمر خلال جسيمات الخلايا المبدئية إلي المتأخرة وصولاً إلى ال (TGN).
وعلى الجهة المقابلة؛ يعبر ال (tac-TGN38) متعدد الخلايا -والذي ينتقل أيضًا بين غشاء البلازما وال (TGN)- خلال الجسيمات البالعة المبدئية إلى المدورة إلى ال (TGN). وبالتبادل؛ فهناك علي الأقل مقال واحد يفترض أن النوع البري (TGN38) قد ينتقل من الجسيمات البالعة المبدئية مباشرةً إلى ال (TGN) في خلايا هيلا (Hella cells).
هناك مسار أخر معقد قد يتبع ب مستقبل (Mannose 6-Phosphate) المعتمد علي دخول الأيونات الموجبة  (CI-M6PR)  والذي ينتقل بين ال (TGN)، غشاء البلازما، وأكلات الخلايا المتأخرة.
ويفترض بالدليل الحي أن (CI-M6PR) ينتقل في غشاء البلازما إلي ال (TGN) مروراً بجسيمات الخلايا المبدئية إلي المدورة إلى ال (TGN).
ويظهر أن عودة (CI-M6PR) خلال الجسيمات البالعة المبدئية قد بدأت بالتقدمخلال المسار المعتمد علي (TIP47/Rab9) إلى ال (TGN).
يتطلب هذا النظام المعقد مسار دقيق خلال الجهاز الحاوي للخلايا لإتمام عملية التوصيل الصحيحة.

أما في الخلايا غير المستقطبة؛ فتضم الجسيمات البالعة المبدئي، والمدورة، والمتأخرة، وأيضًا تضم الجسيمات المحللة. ويزود مستوي التخصصية في هذا النظام عند نقطة التداخل بربط المتراكبات وجسيمات جولجي الصغيرة المرتبطة بال (TGN) علي الأقل.
وعلى سبيل المثال يتطلب توصيل ال((STxBخلال ال (TGN) تواجد مركب ال (GCC185).
وعلى الجانب الأخر يتطلب توصيل مركبي CI-M6P،  TGN38تواجد مركب (TGN38). وعلى الرغم من أن هذه البروتينات الرابطة توفر حساسية عالية عند التداخل، فهي لا تحدد مصدر العضية للحويصلات الموصلة التي تلتقطها هذه البروتينات.
ويستثمر سمي شيجا (STx) والكوليرا المسار العكسي للوصول إلى جسم جولجي والشبكة الإندوبلازمية علي الترتيب. وكلاهما يندرجا تحت تصنيف A–B[sub]5[/sub] بحيث يتم توصيل وحدة A المحللة للإنزيمات إلى العصارة الخلوية خلال المواقع العابرة العكسية إلى خارج الشبكة الإندوبلازمية.
وترتبط وحدة B[sub]5[/sub]بمستقبلات الدهون (Gb3 for Shiga and GM1 for Cholera) وتوجه العملية الحيوية على طول الطريق العكسي.
وقد اكتشفنا حديثاً أن الممر خلال جسم جولجي مطلوب لتوصيل STxإلى (ER). وسيتم قبول فرضية أن سم شيجا يمر خلال الشبكة الإندوبلازمية بعد عملية بلعه.
وقد تم اقتراح أن سم شيجا يسير مباشرة من الشبكة الإندوبلازمية إلى شبكة جولجي (TGN).
وعلى الرغم من ذلك فقد لاحظنا نحن والأخرون أيضاً أن ال STx يمر قبل دخول ال (TGN) خلال التركيبات البالعة للخلاياذوات الأنوية (والتي تشبه كثيراً أكلات الخلايا المدورة).
ولم يتم اختبار الأهمية الفسيولوجية لكل من هذه الممرات، مما يفتح باب الأسئلة عن نوعية الأليات التي تحدث بها العمليات الفسيولوجية، ونوع العضيةالمذكورة، وهل تحديد نوع أكلات الخلايا المدورة مطلوب لعملية سير (STx) إلى ال TGN. 
ويعتبر ال (Retromer) من أهم المركبات البروتينية في عملية السير العكسية.
وال (retromer) هو مركب بروتيني مهم في عملية إعادة استخدام المستقبلات الغشائية ويسمح هذا المركب البروتيني بترتيب الحمولات من الشبكة الإندوبلازمية إلى مسار الجسيمات المحللة.
ويتكون هذا البروتين المستخرج من الثدييات من خمس مكونات تحتوي على متمارئات الخميرة (VPS26/VPS29/VPS35) في مركب صغير واحد.
ويوجد أيضاً في هذا المركب مجموعات كبيرة من البروتينات ذوات القدرة على الارتباط بالغشاء البلازمي ك (SNX). وأهم هذه البروتينات في هذه النوعية من المتراكبات هما SNX1)) وSNX2.
ويعتقد أن معظم عمل (VPS26/VPS29/VPS35) في اختيار الحمولة المناسبة بينما يعتقد أن SNX1/2تستخدم كحجر بروتيني أساسي لعملية توليد الحركة الحيوية للحويصلات الخلوية.
ويعتبر توصيل ال (STx) إلى ال (TGN) المعتمد على المتراكب البروتيني محلٍل ل VPS26 أو لتركيبة ال SNX1 و(SNX2) حيث يؤدي إلي نقص في توصيل (STx) إلى ال (TGN).
ويظل تأثير المركب البروتيني غير واضح في النظام البالع للخلايا. وبالمثل فإن توصيل (CI-M6PR) إلى ال TGN يعتمد علي وظيفة المتراكب البروتيني كموصل لل TGN.
وعلي النقيض فإن توصيل مركب الفيورين خلال الجسيمات البالعة للخلايا المتأخرة لا يتأثر بتحلُل أو تفكك المتراكب البروتيني Retromer.

وقد تم ملاحظة هذا المتراكب البرويتيني (Retromer) في (EEA-1 positive EE) حيث يتوسط ترتيب الحركة الحيوية العكسية مثل سير STxB في الأنيبيبات الإيجابية ل (SNX1).
وبسبب نفاد مركب ال(Transferrin)  من تلك الأنابيب، فقد تم اقتراح ذلك أن تلك الأنابيب تحمل الحركة الحيوية للمواد عبر الأغشية مباشرة من الشبكة الإندوبلازمية إلى ال TGN.
وعلى الرغم من ذلك فإن بعض المواد المحمولة ك CI-M6PR وSTxB المعتمدة على المتراكب البروتيني Retromer  قد تم ملاحظتها بالقرب من الTGN في تجمعات الخلايا مركزية النواة أو تواجده صراحةً في الجسيمات البالعة المدوٍرة. ويتفاعل مكون المتراكب البروتيني Retromer (VPS26) مباشرةً مع الجسيمات البالعة المدوِرة المرتبطة ب (EHD-1).
ومن الظاهر أن بروتين (EHD-1) نفسه مطلوب على الأقل لبعض العمليات العكسية ل (CI-M6PR) إلى ال (TGN بشرط انخفاض درجات الحرارة (أو وجود ثلج في التفاعل).
هذه الدراسات تفترض وجود دور للجسيمات البالعة المدوِرة في عملية الحركة الحيوية العكسية للحمولات المعتمدة على المتراكب البروتيني Retromer ولكن لم يتم تقدير الأهمية الوظيفية للجسيمات البالعة لمدوِرة في الحركة الحيوية. وإذا كانت هذه الجسيمات مهمة كمحطة في الطريق للعمليات الحيوية العكسية، فإن إدراجها كجسيمات بالعة مدوِرة للخلايا لا يمكن أن يتساوي مع التوصيل المباشر لل TGN, وتتضمن تجمعات الخلايا مركزية النواة خطوة محددِة ثانية في الطريق. وعلى الرغم من ذلك فلو أن الحمولات المعتمدة علي المتراكب البروتيني Retromer  في أكلات الخلايا البدائية تتجه مباشرة إلى ال TGN، فإن تجمعات الخلايا مركزية النواة أثناء الحركة العكسية من الممكن أن تنقل المركبات الوسطية بكل بساطة مجمٍعةً إياها  بالقرب من ال TGN.
من المحتمل أيضًا أن يتوسط المتراكب البروتيني retromer الحركة الحيوية في كلا المسارين بالتوازي.

ولاختبار أهمية الجسيمات البالعة المدورة في الحركة الحيوية العكسية المعتمدة علي المتراكب retromer في الخلايا الحية، فقد فحصنا حركتين حيويتين لحمولتين مختلفتين تماماً من الجسيمات البالعة المبدئية إلى
ال (TGN). وقد كانت أول عينة عبارة عن مركب متعدد الخلايا المختلفة CD8-CI-M6PR طورها الباحث (Seamanوالتي توضح الخيوط البروتينية الممتدة خارج غشاء البلازما لمركب CD8، وأيضاً الذيل السيتوبلازمي لمركب CI-M6PR)). 
بينما لا تتطابق هذه التركيبة مع الطول الكلي ل (CI-M6PR)، ومع ذلك فقد تم استخدام هذه الحركة الحيوية للمراقبة من غشاء البلازما إلى جسم جولجي. وهذه الحركة معتمدة على المتراكب البروتيني Retromer. وبالتالي فهو بروتين معبرعن خاصية نفاذية الغشاء المرتبط بالمواد المحمولة المعتمدة علي المتراكب البروتيني Retromer. والعينة الثانية كانت على ال  (STxB)وهو عبارة عن وحدة B[sub]5[/sub] لسم shiga)). وقد تم ملاحظة أن حركة هذا البروتين مطابقة تقريباً لأنواع السموم المندرجة تحت تصنيف (A–B[sub]5[/sub]), ولكن ينقصه بعض الخصائص السُمٍية. وتعتمد أيضاً عملية السير الحيوية لمركب STxB إلى ال (TGN) أيضاً علي المتراكب البروتيني Retromer.
فنجد أن عملية السير الحيوية خلال الجسيمات البالعة المدوِرة هي الطريق الواضح الطبيعي لعملية النقل العكسية لكلٍ من هذه البروتينات خلال الجهاز الناقل أو الحاوي للخلايا.


النتائج
لفحص تصنيف الحركة العكسية خلال الجهاز البالع للخلايا، استخدمنا خلايا (BSC-1). وهذه الخلايا المعبرة عن مستقبلات (Gb3) و(STxB يمكن بالفعل أن تسمح للأحماض النووية بدخول خلايا معظم الثدييات، كما أن لها شكل سطحي يسمح بتمييز الخلايا مركزية النواة في الجسيمات البالعة المدوِرة من المبدئية وأجسام جولجي. بحيث تتواجد الجسيمات البالعة المدورة في مركز الأنيبيبات المنظم لعملياتها الحيوية. ويمكن تمييزها بوضوح من ال (TGN) المحيط به.
ويمكن حساب اللفة الكاملة النسبية بين الجسيمات البالعة المدوٍرة وأجسام جولجي بصور عديدة ومنها اعتبار (n=11) بحيث يصبح معامل بيرسون الدولي للارتباط (PCC) لهذه المقارنة 0.11 +/− 0.083) للجسيمات البالعة. وسميت ب Tfn مقابل أجسام جولجي المسماه ب GM130)). وقد يصبح هذا المعامل صغيراً بصورة خاطئة إذا اختلف شكل توزيع الدلالتين خلال الحجيرات الخاصة بهذه الخلايا الحيوية. حينها اتبعنا البروتوكول الخاص ب (Dunn et Al).
وتم استخدام معاملات ارتباط ماندر (MCC)أيضاً في حساب اللفة الكاملة بين الحجيرات.
وبمقارنة الجسيمات البالعة بأجسام جولجي فوُجد أن معامل ارتباط ماندر لها هو= . 0.161 +/− 0.08أما بالنسبة لأجسام جولجي فكانت 0.119 +/1 0.095مع الوضع في الاعتبار أن (n=11) لكليهما.
وقد فسرنا هذه الأرقام بالنتائج التالية: 16% فقط من الجسيمات البالعة للخلايا قامت بدوراتها وصولاً لأجسام جولجي، و12% فقط من أجسام جولجي قامت بدوراتها وصولاً لأكلات الخلايا.
وبالمثل فبمقارنةً ال (PCC) لأكلات الخلايا (Tfn) بال (TGN) المسماه TGN46 فكانت 0.147 +/− 0.019 (n=4) ... أما عن معامل ماندر للارتباط فكان للجسيمات البالعة0.198 +/− 0.022...
وبالنسبة لل (TGN) 0.136 +/−0.011 (n=4) .
وبجمع هاتين النتيجتين نتوصل إلى  اختلاف الجسيمات البالعة المدورة وأجسام جولجي في هذه الخلايا باستخدام رؤية الوميض الخاص بتلك الخلايا. ويمكن بالمثل التمييز بين الشبكة الإندوبلازمية والجسيمات البالعة المدورة باستخدام عينة (Alexa 488-Tfn) بنقعها وذلك بالنسبة للجسيمات البالعة المبدئية لمدة 2.5 دقيقة, وبنقع (Alexa 546-Tfn) لمدة 25 دقيقة  وذلك بالنسبة للجسيمات المدوِرة في خلايا (BSC-1 cells) المعبرة عن مستقبلات مركب ال Transferrin في البشر.
وقد استخدمنا هذا النظام سابقاً في استخراج الجسيمات البالعة المدورة بطريقة مادية من الأغشية الدقيقة بالإضافة إلى متابعة الحركة الحيوية ل (STxB) خلال ال (TGN) وأجسام جولجي. 

تواجد كل من STxB  وCl-M6PR بالتوازي في أكلات الخلايا المدورة أثناء عملية النقل الحيوية العكسية
وقد طبقنا كلاً من Alexa 546-STxB و(Alexa 488-Tfn) على خلايا (BSC-1) في وجود درجات حرارة منخفضة كالثلج. ثم غمس الليجندات عند درجة37° C   أكثر من مرة لمراقبة تصنيف الجهاز البالع للخلايا ثم يتم ترقيم هذه الخلايا مناعياً برقم (TGN46)لمعرفة ال (TGN). ورقم (Rab11a) لمعرفة الجسيمات البالعة المدوِرة في خلال دقيقة.
ويصبغ ال (STxB) باللون الأحمر بالتوازي مع (Tfn) باللون الأخضر في نقطة طرفية واضحة مشيرة إلى الشبكة الإندوبلازمية. ولا يتواجد ال (STxB) مع ال TGN46 المصبوغ باللون الأزرق أو مع دليل الجسيمات البالعة المدوِرة (Rab11a) المرقمة بكود (Alexa 350) والتي تظهر هنا أيضاً باللون الأخضر. وبعد 7دقائق يتواجد ال (STxB) بالتوازي مع ال (Tfn) بدرجة أقل ولكن ليست أقل كثيراً، وتظهر الأن في الشبكة الإندوبلامية وأكلات الخلايا المدوِرة. فيتحول ال (PCC) لل (Tfn) مقارنة ب (STxB) من 0.649 +/− 0.079)) عند (n=6)في الدقيقة الواحدة إلى 0.464 +/− 0.146عند (n=14)عند 7دقائق. ويعطي ناتج MCC[sub]STxB[/sub] ناتج مشابه بالضرورة.
وعلى الرغم من تواجد الأغلبية العظمي من ال Tfnفي أكلات الخلايا المدورة، تظل البقية الباقية في الجسيمات البالعة المبدئية. وبالتالي يصبح تواجد هذه الخلايا بالتوازي مع ال (Tfn) لا يعني بالضرورة أن ال STxB يدخل الجسيمات البالعة المدوِرة. ويعتبر ((Rab11a مسجل أخر لأكلات الخلايا المدوِرة. ولذلك قارننا تواجد (STxB) مع (Rab11) بالتوازي في نفس الخلايا، فظهر أن ال (STxB) يصبح في أكلات الخلايا المدوِرة خلال 7دقائق كذلك مع المسجل. ومع مقارنة ال (STxB) بال (Rab11) وجد أن ال PCC قد بلغ ذروته عند الدقيقة السابعة لأكثر من 2.5دقيقة 
(p < 0.001) والتقطير بشكل أكبر من الدقيقة 7 حتي الدقيقة 19(p<0.001). وقد افترضت هذه النتائج أن عبور ال (STxB) خلال الجسيمات البالعة المدوِرة عند الدقيقة السابعة. وعلي النقيض؛ فعند مقارنة STxB بال TGN46، فوجد أنه ما بين الدقيقة الأولى إلى السابعة قل نسبياً تواجدهم في الخلايا بالتوازي، وتزيد بصورة واضحة (p < 0.001) عند الدقيقة 19(PCC = 0.502 +/− 0.186, n=17).
وقد افترضت هذه النتائج تطوراً واضحاً لل (STxB) من أكلات الخلايا المدورة إلى ال (TGN)
بعد ذلك قمنا بمراقبة الحركة الحيوية العكسية لمستقبل سكر المانوز المتعدد الخلايا (mannose 6-phophate) خلال الجهاز الأكل للخلايا مثل (STxB)، ويتطلب هذا المستقبل المعتمد في فعله علي الأيونات الموجبة
(mannose 6-phosphate) يتطلب مركبات ال (SNX1) ليسير خلال الجهاز الأكل للخلايا وصولاً لل (TGN).
وفي هذه الحالة يعتقد أن الذيل السيتوبلازمي للCI-M6PR يتفاعل مع وحدة (VPS26/VPS29/VPS35) المكونة للمتراكب البروتيني Retromer. ويتم هذا التفاعل خلال الارتباط المباشر ب (VPS35).
فقد استخدمنا تركيب متعدد الخلايا يحتوي علي سلسلة بروتينية من ال (CD8) مندمجة مع الغشاء العابر وسلاسل بروتينية من CI-M6PR (وقد عرفها العالم Matthew Seaman ب CD8-M6PRكلفتة طيبة منه. يوفر هذا التركيب جسم مضاد محكم رابطاً موقعاً للخلايا الحية المرقمة عند الاحتفاظ بخصائص عملية السير الحيوية ل (CI-M6PR).
بينما تصبح هذه الخصائص مختلفة قليلاً عنها في النوع البري (CI-M6PR). بينما تظل هذه الحركة معتمدة علي المتراكب البروتيني Retromer ودليل حي يفترض أنها يمكن أن تمر هي والنوع البري خلال الحجيرة الأكلة للخلايا . 
ويمكن لخلاياBSC-1 أن تستعمر بوابل من CD8-M6PR متعدد الخلايا.
وقد تم تطبيق (Alexa 546-anti-CD8 Ab) وAlexa 488-Tfn على الخلايا علي البارد ثم تم غمسها عند درجة 37° C  لل (STxB).
وللتسهيل علي القارئ فسنشير إلى ال (anti-CD8 Ab) المرقم المرتبط ب CD8-M6PRب (CD8-M6PR).
ولن يتم التطرق إلى التركيبات غير المرقمة في مقالنا هذا. وقد اتضح أن الجسم المضاد يظل مرتبط كمياً بالتركيب داخل الخلية. واتضح أيضاً أن غمس ال CD8-M6PR لم يكن بنفس كفاءة ال STxB الناتج من الترقيم المتواصل لغشاء البلازما. ولهذا السبب فقد كان من اللازم غسل أسطح الخلايا في وسط حمضي (pH 3.0) لإزالة الأجسام المضادة الغير مغموسة بعد 3دقائق من الغمس. ويتواجد ال (CD8-M6PR ) مع ال Tfnفي الشبكة الإندوبلازمية بعد 5 دقائق PCC = 0.488 +/− 0.237, n=7. وبعد 7دقائق يتواجد ال (STxB) مع ال Tfn نتيجة التحول من الشبكة الإندوبلازمية للتواجد معاً في أكلات الخلايا المدوِرة
عند  (PCC = 0.621 +/− 0.171, n=13). ويقل تواجد CD8-M6PRمع ال (Tfn) عند الدقيقة ال20
(PCC = 0.250 +/− 0.128, n=10). ويظل في ال (TGN) عند الدقيقة ال30 من الغمس. ويوحي هذا بتقدم مماثل له في ال STxB. ويمر على الأقل واحداً من ال CD8-M6PRخلال الجسيمات البالعة المدوِرة. لكنه لم يكن من الواضح هل هذه كمية كافية بشكل واضح أم أن كمية CD8-M6PR مرت مباشرة من أكلات الخلايا المدورة إلى ال (TGN). 

وقد أدت النتائج إلى طرح سؤال وهو "ما هو الجزء الذي يمر خلال أكلات الخلايا المدوِرة في العملية الحيوية العكسية المعتمدة علي المتراكب البروتيني retromer؟" وقد كشفت دراسات EM عن مكونات ال Retromer المرتبطة الجسيمات البالعة الموجبةEEA-1  المعبرة عن الشبكة الإندوبلازمية، بينما الجسيمات البالعة المدوِرة تعتبر EEA-1 negative . والأبعد من ذلك, فلتحلل الretromer  تأثير صغير إذا وجد على إعادة استخدام (Tfn) خلال الجهاز الأكل للخلايا. تسير الحركة الحيوية في طريق من الشبكة الإندوبلازمية خلال الجسيمات البالعة المدورة بالإضافة إلى الطريق الأخر من الشبكة الإندوبلازمية مباشرةً إلى غشاء البلازما. وهكذا يظل من المحتمل أن الخلايا مركزية الأنوية (STxB) و(CD8-M6PR ) تعبر عن تجمعات من المواد الوسطية الناقلة في منطقة أكلات الخلايا المدوِرة، ولكن لا يمكن تمييزها بالعين المجردة عن الجسيمات البالعة المدورة.

المسار الأساسي للحركة الحيوية العكسية هو المسار خلال الجسيمات البالعة المدورة.
لاختبار أهمية أكلات الخلايا المدوِرة المعتمدة على المتراكب البروتيني Retromer في الحركة الحيوية العكسية؛ تم تحليل وظائف العضية؛ فوُجد أن الحركة الحيوية لل Tfn في خلايا (BSC-1), CHO, MDCK, (HeLa) هي حركة مميزة جداً. فيمتلك كلهم حركات مشابهة جداً لعبور ال Tfn خلال المسارات المدوِرة مما يسمح بانتقائية وتخصصية عالية لل Tfn و(Tfn conjugates) لاستهداف كلٍ من الشبكة الإندوبلازمية، أو أكلات الخلايا المدوِرة. ويتم ذلك عن طريق ارتباط ال (Tfn) على البارد متبوعاً ب 25دقيقة من الملاحظة الجيدة مما يوفر ترقيم جيد للجسيمات البالعة المدوٍرة. وقد استفدنا من ذلك نحن والأخرون لهدف محدد لإنزيم البيرأوكسيديز (الفجل الحار) بترقيمه علي ال (Tfn) بكود (HRP-Tfn) على الجسيمات البالعة المدوِرة. فتحللت عند معاملتها ب (H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]/DAB ) على البارد لمدة ساعة واحدة. ويزيل هذا التحلل الأثر الوظيفي لها. بينما تظل الجسيمات البالعة المبدئية والمتأخرة سليمة من حيث الوظيفة. وللتأكد من التخصصية العالية؛ فقد فحصنا قدرة الشبكة الإندوبلازمية علي إعادة تدوير ل Alexa 488-Tfn. وقد رٌقِمت الخلايا المتحللة ل Alexa 488-Tfn بذبذبات متواصلة لمدة 30دقيقة عند درجة 37 مئوية (بدون متابعة). وقد أدي ذلك إلى ترقيم المسار الداخلي للتدوير. وقد كانت الشبكة الإندوبلازمية الطرفية واضحة المعالم في كلٍ من خلايا العينة المتحكم بها وأيضاً من الخلايا المتحللة. لكن الجسيمات البالعة المدوِرة مركزية النواة كانت واضحة فقط  في خلايا العينة المتحكم بها. وبعد 30دقيقة من المراقبة لخلايا ال (Tfn) غير المرقمة. ولا تحتفظ الخلايا المتحللة بال Tfn. واحتفظت خلايا العينة المتحكم بها بأجزاء صغيرة جداً من ال (Tfn) في الجسيمات البالعة المدوِرة. وقد ثبت أن العبور السريع للجسيمات المدوِرة خارج الجسيمات البالعة المبدئية مازال فعال في الخلايا المتحللة. ولفحص ثبوت تأثر ترتيب الجهاز الأكل للخلايا من البدائية، للمتأخرة، للمحللة؛ فقد تم تعبئة الخلايا المتحللة ب (Alexa 488-Dextran) وهو عبارة عن مسجل حاوي للخلايا في الحالة السائلة. وقد تم توصيل الدكستران إلى أكلات الخلايا المتأخرة والمتحللة ويتم ربطه بصبغة ال (lysotracker ) كما في الخلايا غير المعالجة بها. ولاختبار هل عطلت المواد المستخدمة للتحلل خلايا الحركة الحيوية خلال ال (TGN)عبر الجسيمات البالعة المتأخرة بدلاً من الجسيمات البالعة المدوِرة, فقد راقبنا تركيبة الحركة الحيوية لل (Flag-furin). ويتواجد مركب ال Furin كبروتين في ال TGN, حيث يعود من غشاء البلازما خلال الحركة الحيوية العكسية.  ويسير كل من (Tac-furin) وFlag-furinعبر الجسيمات البالعة المتأخرة وصولاً إلى ال (TGN) بدلاً من السير عبر الجسيمات البالعة المدوِرة. وقد تواجد ال (Flag-furin ) في خلايا (BSC-1). ويرتبط (Anti-Flag Ab) بالخلايا ويغمس لمدة 60دقيقة لمراقبة نقع مركب ال (furin). وفي خلايا العينة المتحكم بها فقد تم توصيل ال (Flag-furin) إلى ال (TGN) حيث يتواجد في هذه الخلايا بالتوازي مع (TGN46) (PCC = 0.424 +/− 0.151, MCC[sub]furin[/sub] = 0.246 +/− 0.110, MCC[sub]TGN[/sub] = 698+/− 0.125) .. والجدير بالذكر أنه قد تم شغل ال (TGN) بصورة كبيرة بتركيبة ال (furin), حيث تم رؤية تركيبة ال (furin) في ال ((TGN بشكل يشبه غشاء البلازما، حيث ظهر أن معامل ارتباط ماندر لل (TGN) أعلي منه لل (furin) (the MCC[sub]TGN[/sub] was higher than the MCC[sub]furin[/sub]). أما في الخلايا المحللة فوجد أنه قد تم توصيل ال Flag-furin إلى ال TGN(PCC = 0.743 +/− 0.169, MCC[sub]TGN[/sub] = 0.824 +/−0.145, MCC[sub]furin[/sub] = 0.564 +/− 0.226) .. ولم يتضح سبب ظهور تصنيف أو نقع ال (Flag-furin) أنه الأكثر كفاءة في الخلايا المحللة. ولكن أثبتت هذه النتائج أن المسار غير معتمد علي المتراكب البروتيني Retromer
 (عبر الجسيمات البالعة المتأخرة) يظل يقوم بوظيفته حتى بعد التحلل في أكلات الخلايا المدوِرة.

وبأخذ كل هذه النتائج في الاعتبار؛ نتوصل إلى أن تصنيف ال (Ligands) -في الشبكة الإندوبلازمية، والنضوج في أكلات الخلايا المتأخرة، والوصول إلى ال (TGN) عبر أكلات الخلايا المتأخرة- لم يتأثر بتحلل أكلات الخلايا المدوِرة. وقد أثبت الأخرون أن خطوات هذا التحلل لا تؤثر علي وصول الحمولات جانبية النواة، أو حتى الحمولات قمِية النواة غير المرتبطة ب (μ[sub]1[/sub]B) من ال (TGN). مرة أخري يفترض أن هذا التحلل -كما حدث في هذه التجربة- هو مخصص للجسيمات البالعة المدوٍرة.

بعد ذلك قمنا بفحص أثار تحلل الجسيمات البالعة المدوِرة على الحركة الحيوية العكسية. ويتم توصيل (Alexa 546STxB) إلى جسم جولجي بشكل طبيعي (المرقمة هنا بالمسجل المركزي GM130) في خلال 60دقيقة. عند الدققيقة 60 نجد أن (PCC = 0.689 +/− 0.103, MCC[sub]STxB[/sub] = 0.556 +/− 0.158, n=12)). بينما تصل إلى الشبكة الإندوبلازمية  خلال 180دقيقة. وعلى الرغم من ذلك, ففي الخلايا المتحللة نجد أن (Alexa 546-STxB) قد اتخذت شكلاً مختلفاً بشكل كبير. فعند الدقيقة 60 لم يظهر جسم جولجي بشكل واضح ((p < 0.0001) ... بحيث يصبح أقل تواجداً مع ال GM130. (PCC = 0.038 +/− 0.080, MCC[sub]STxB[/sub] = 0.029 +/− 0.048, n=12) .... لكن بعد النقع, فقد تبقي ال (STxB) في نقطة محددة  طرفية لمدة 3ساعات علي الأقل. وأيضاً لا يتواجد مع ال PDI الموجود في الشبكة الإندوبلازمية في هذا الوقت. ويفترض ذلك أن الجسيمات البالعة المبدئية لا يمكن أن تعبر بجانب الجسيمات البالعة المدوِرة. مما يعني أن هذا المرور خلال الجسيمات البالعة المدوِرة كان مساراً واضحاً للحركة الحيوية العكسية ل STxB.

وقد قمنا بتجربة مشابهة مع ال CD8-M6PR لاختبار هل تم منع سير الحركة الحيوية ل CD8-M6PR في الخلايا التي يحدث بها تحلل للجسيمات البالعة المدوِرة. وعادةً ما يدور ال CD8-M6PRبين غشاء البلازما وال (TGN) وليس في جسم جولجي المركزي. وصبغنا بعد ذلك خلايا ال TGN46 بدلاً من GM130. وقد استغللنا ميزة صبغ الخلايا وقمنا بنقع (Alexa 488-Tfn) طولياً مع الجسم المضاد CD8)). وقد سمح لنا ذلك بالتعرف علي الجسيمات البالعة المدوِرة (بعد 30دقيقة) في خلايا العينة المتحكم بها. أما في الخلايا المتحللة فقد تم إعادة استخدام كل ال Tfn خارج الخلايا بوصولنا للدقيقة60 مما أكد أن التحلل لم يمنع إعادة الاستخدام من حجيرة الجسيمات البالعة المبدئية.

وقد وُجد CD8-M6PR لزاماً مع ال ((TGNفي خلايا العينة المتحكم بها بعد 30دقيقة من النقع (PCC = 0.835 +/− 0.087, MCC[sub]CD8-M6PR[/sub] = 0.793 +/− 0.0.138, n= 4 ... واستمر (CD8-M6PR) مع ال (TGN) بعد 60دقيقة. أما في الخلايا المتحللة فقد وُجد بشكل جزئي مع ال (Tfn) الطرفي في الجسيمات البالعة المبدئية بعد 10دقائق أو حتي 30دقيقة من النقع. وقد ظل بعض ال (CD8-M6PR ) في مكانه في النقطة الطرفية. ولم تتواجد بشكل واضح مع ال (Tfn). أما إذا انتظرنا لأوقات أطول فنجد خروج ال (Tfn) من الخلايا ثم إعادة استخدامها مرة أخري. مما يمنع تواجدها مع أي مركبات أخرى داخل الخلية. والأهم من ذلك، فمركب (CD8-M6PR) لا يتواجد لزاماً مع مسجل ال (TGN) عند الدقيقة30. (PCC = 0.002 +/− 0.019 MCC[sub]CD8-M6PR[/sub], n=6) ... ويحدث نفس الشئ بعد 60دقيقة أيضاً(PCC = 0.039 +/− 0.031, MCC[sub]CD8-M6PR[/sub]= 0.045 +/− 0.034 n=6 ... وفي كلا الحالتين: فإن قلة التواجد مع ال (TGN) كان واضحاً أنه مختلف بصورة كبيرة عنه في خلايا العينة المتحكم بها (p < 0.0001). في الواقع بقي CD8-M6PR في النقطة الطرفية. وقد أشار ذلك إلى أن تحلل أكلات الخلايا المدوِرة في حالة ال (STxB) قد منع (CD8-M6PR) من السير إلى ال (TGN). والتفسير الأبسط الواضح لهذه النتائج هو أن العبور خلال الجسيمات البالعة المدوِرة لهو خطوة مطلوبة لكلٍ من حمولات متراكب ال retromer  من الجسيمات البالعة المبدئية إلى أجسام جولجي. وعلى الرغم من ذلك, فيظل من الممكن أن معالجة هذه الخلايا بمواد مسببة للتحلل قد يكون عطل العصارة الخلوية للمتراكب البروتيني retromer قليلاً. أو أثر بشكل عكسي علي عملية السير الحيوية المتجهة للعضيات.

مصير الحمولات غير المنظمة أو مصنفة
أما تحت ظروف التحلل، فقد تم ملاحظة كلِ من CD8-MPR وSTxB في النقطة الطرفية. وقد اختبرنا هل كان اتجاههم إلى نفس التركيبات أولاً. أما الخلايا المعبرة عن CD8-M6PR فقد تم ترقيمهم بكلِ من الجسم المضاد (CD8) و(STxB) لمدة 60دقيقة. وقد تم صبغ خلايا (TGN46) أيضاً. وقد تواجد كلُ من (CD8-M6PR) و(STxB) معاً في نفس التركيبات الطرفية .. (PCC = 0.421 +/− 0.125 MCC[sub]CD8-M6PR[/sub]= 0.409 +/− 0.140, MCC[sub]STxB[/sub]= 0.361+/− 0.159, n=9 ... ولم يسير أيُ منهما إلى ال TGN. وقد سمح لنا ذلك باستخدام (Alexa 546-STxB) للحصول علي سمات وأشكال أوضح منها في التركيبات الطرفية. وقد فضلنا (STxB) للاستخدام الفني لهذه الدراسة. 
ولتحديد مكان وصول ال (STxB) في الخلايا المتحللة بشكل أفضل، فقد نقعنا (Alexa 546-STxB) لمدة 60دقيقة. وقد أشارت النتائج توفر وقت كبير لها للوصول إلى جسم جولجي. وتعتبر الوجهة الواضحة للحركة الغشائية للخلايا غير المرتبة هي الخلايا المحللة. وبالتالي فقد بحثنا عن تواجد كلِ من (STxB) و (lysosomes) المنقوعين باستخدام صبغة (lysotracker). أما في خلايا العينة التحكم بها فكما هو متوقع، فهي لم تضل الطريق إلى الخلايا المحللة في عينة الخلايا المتحللة. بينما كانت التراكيب الحاملة لل (STxB) قريبة غالباً من تراكيب الخلايا المتحللة، ولكننا لم نلاحظ إطلاقاً وجودهم معاً بالتلازم. بعد ذلك بحثنا أكثر لتحديد هل تم وصول ال (STxB) إلى الجسيمات البالعة المتأخرة أم إلى الخلايا المحللة قليلة الحمضية في الخلايا المتحللة. وهناك بعض التركيبات من المحتمل عدم رؤيتها بواسطة صبغة ال (lysotracker) مثلLAMP1و (LAMP2). وعند مقارنة التركيبتين ببعضهما (الأجسام المضادة المكونة لكلِ من LAMP1/2)، فقد ثبت أن ال STxB لم يتم توصيله إلى أماكن الجسيمات البالعة المتأخرة في الخلايا المتحللة. وبالتالي لم تكن مختلفة بشكل كبير عن نظيرتها في عينة الخلايا المتحكم بها. وكان من الممكن أنه في غياب وظيفة الجسيمات البالعة المدوِرة، يحتمل أن تبقي ال (STxB ) في الجسيمات البالعة المبدئية أو تصل إلى أماكن الخلايا المشابهة الجسيمات البالعة المدوِرة. وقد قارننا ال STxB  مع ال EEA-1 positive EE. فوُجد أن التحلل لم يسبب دوران أو سير واضح لهذه الخلايا إلى هذه الأماكن. وقد تواجد Rab11aبشكل مبدئي في الجسيمات البالعة المدوِرة، ولكنه أيضاً ظاهر بشكل أقل كثيراً في الجسيمات البالعة المبدئية. ولا يتواجد STxB مع (Rab11a) في الخلايا المتحللة. مما يشير إلى أنها لم تكن محتبسة في أجزاء من الجسيمات البالعة المدوِرة. وبأخذ هذه النتائج معاً، نجد أنه عندما تتحلل الجسيمات البالعة المرتبطة معهم، تظل الحمولة المرتبطة بالمتراكب البروتيني retromer موجودة في الجسيمات البالعة المبدئية. ولكنها تضل الطريق إلى حجيرات أخرى.

وتسبب خطوات عملية التحلل خلق راسب ال (DAB) في الجسيمات الباللعة المدوِرة. وعلى الرغم من ذلك، من الممكن لهذا الراسب أو حتي الكواشف المستخدمة أن يبطل مكونات المتراكب البروتيني retromer. مما يجعل عملية السير الحيوية أمر صعب الحدوث. وفي هذه الحالة، سنتوقع أن واحداً أو كلاً من المتراكبات البروتينية الصغيرة المكونة ل retromer لن تظل مرتبطة مع حمولة ال (STxB) عندما تكون غير مرتبة أو منظمة. ولذلك فقد فحصنا أماكن تمركز كلٍ من ال SNX1(SNX1/SNX2 sub-complex), والVPS35(VPS26/VPS298/VPS35 subcomplex) مقارنةً بال (STxB) المنقوع في الخلايا المتحللة. ويمتلك مركبي (STxB) و(SNX1) توزيعات مسارية كبيرة ولكنها مختلفة في كلا العينتين المتحكم بها والخلايا المتحللة
. (PCC = 0.327 and PCC = 0.505 respectively بالإضافة إلى ذلك، فقد تمركز ال (VPS35) ناحية اتجاهات مضللة في الخلايا المتحللة. (PCC = 0.370 +/− 0.118, MCC[sub]VPS35[/sub] = .290 +/− 0.086 n=9). وقد أشار ذلك إلى أن كلاً من الretromer  و(STxB) كانوا في تلك الحجيرات. وهكذا فلم يحدث أن تورط ال STxB في الحجيرات بسبب نقصٍ ما في الدخول لل retromer. ولازال من المحتمل أن يكون هذا المتراكب البروتيني retromer  معطل بطريقة أو بأخرى. ولكن من الواضح أنها لم تكن محتبسة في الجسيمات البالعة المدورة المتحللة، ولا حتي معزولة عن ال (STxB ) في الجسيمات البالعة المبدئية.

عزل (ٍ(StxB عن ((CD8-M6PR في الجسيمات البالعة المدوِرة بسبب الاعتماد علي 1  EHD
يعتبر بروتين (EHD1) كحجر أساس يقع في الجسيمات البالعة المدورة، حيث أنها مطلوبة لخروج ال ((Tfnعند إعادة تدوير الخلايا. وقد اختبرنا إمكانية أن تعتمد الحركة الحيوية العكسية على ال (EHD1) أيضاً. وقد اتضح أن بروتين ال (EHD1) يتفاعل مع ال (retromer) في أكلات الخلايا المدوِرة, ومع ذلك, فقد يسبب ذلك صعوبة في تكوين المفاهيم, حيث يتمركز (EHD1) في الجسيمات البالعة المدوِرة بدلاً من المبدئية. أما بالنسبة عن النوع البري (GFP-EHD1) الذي يظهر بمستويات قليلة, فهو ليس له تأثير علي وصول ((STxB إلى ال (TGN). وقد تم تطبيق (Alexa 546-STxB) علي الخلايا المعبرة عن النوع البري (GFP-EHD1) ويتم غمسه كما حدث قبل ذلك. وعبرت خلال الجسيمات البالعة المبدئية عند 2.5دقيقة. وتتواجد لزاماً مع ال (EHD1) في الجسيمات البالعة المدوِرة عند 10دقائق حتي بعد 20دقيقة وتستمر وصولاً إلى 60دقيقة. ويتواجد (STxB) لزاماً مع (TGN46). (at 60 min PCC = 0.672 +/− 0.134, MCC[sub]STxB[/sub]= 0.735 +/− 0.158 n=8;). كما هو ملاحظ في الخلايا غير المعالجة. ويؤدي التعبير الزائد ل (GFP-EHD1) إلى تشكل الجسيمات البالعة المدوِرة علي شكل أنابيب بشكل زائد جداً. لذا يتم اختيار الموجودة بمستويات صغيرة في التركيبات (التي يمكن تحديدها بالعين المجردة).

وللتشويش علي الحركة الحيوية لل STxB من الجسيمات البالعة المدوِرة. فقد كشفنا (negative (DN) GFP-EHD1) هو الموجود بشكل كبير. وسماها Barth Grant G429R. ويعرف هذا التركيب بقدرته علي منع إعادة استخدام (Tfn) من الجسيمات البالعة المدوِرة. ومع ذلك؛ فتختلف عن طفرة (T72N)P-loop وتختلف عن إزالة سلسلة EH المستخدمة في الدراسات السابقة المرتبطة بالمتراكب البروتيني retromer. أما عن الطفرة (G429R) فهي تظل مرتبطة بالجسيمات البالعة المدوِرة مما يسهل التعرف علي العضية. ولل (DN GFP-EHD1) تأثير عميق علي الحركة الحيوية لل (STxB) خارج الجسيمات البالعة المدوِرة. وقد احتبس ال (STxB) في الجسيمات البالعة المدوِرة في كل الأوقات بعد 10دقائق من الغمس. وحتى بعد 60دقيقة فلا نجد (STxB) مع ال (TGN46) .. (PCC = 0.065 +/− 0.105, MCC[sub]STxB[/sub]= 0.095 +/− 0.182 n=6., ولكنها تبقي في الجسيمات البالعة المدوِرة. هذا التواجد المتلازم  في الخلايا بصورة كبيرة (p < 0.0001)يختلف عنها في عينة الخلايا المتحكم بها. ولا يتأثر بذلك خروجها من الجسيمات البالعة المبدئية. أما في الخلايا المتحكم بها أكثر والمتابعة بصورة أكبر؛ فتبقي بعد الخلايا لا تسمج بولوج خلايا أخري داخلها. وفي هذه الخلايا يتواجد (STxB) مع ال (TGN) بصورة كاملة.

ولتحديد تأثير (DN-EHD1) بشكل مبعدي؛ فقد استخدمنا مقالاً بيوكيميائياً لمراقبة الحركة الحيوية لل (STxB). ويحتوي ال (STxB) المعدل علي مجموعتين كبريت بالترتيب (STxB-SS, kindly provided by Ludger Johannes) ... وقد تم تطبيقها علي الخلايا في وجود [sup]35[/sup]SO[sub]4[/sub] . وهذه العملية يتم معالجتها بإنزيم (sulfonyl transferase) في ال (TGN). وتحدث عملية الكبرتة بعملية تجانس للخلايا. ووضع كميات متساوية من البروتين علي (SDS PAGE gels). ويتم الحصول علي حزمة من (7.5 KD) المشعة فقط في وجود (STxB-SS) ومجموعة الكبريت. ويتم قياس هذه الحزمة بواسطة مصورالفوسفور. وقد تم استخدام هذا المقال بشكل موسع لقياس وصول ال (STxB) إلى جسم جولجي. وقد وجدنا أنه قد تم منع وصولها إلى جسم جولجي بنسبة 69%. أما ال31% المتبقية فمن الممكن أن تكون قد نتجت عن الخلايا التي لا تسمح بولوج خلايا أخري إليها كال DNA, أو حتى من المتبقي من الحركة الحيوية في وجود التركيبة السالبة الغالبة على هذه الخلايا. وبأخذ هذا في الاعتبار مع النتائج؛ ويشير ذلك إلى أن كمية كبيرة من الحركة الحيوية العكسية  من (STxB) لل (TGN) تعتمد علي ال (EHD1). وحيثما تبدأ الحركة الحيوية في الاحتباس في الجسيمات البالعة المدوِرة؛ فمن المحتمل أن يكون ال (EHD1) متطلب للحركة الحيوية العكسية خارج الجسيمات البالعة المدوِرة. وبعد لك قمنا بفحص تأثير (DN GFP-EHD1) علي حركة ال (CD8-M6PR). وقد أثبتت الدراسات السابقة لمتطلبات ال (EHD1)  لوصول ال (CD8-M6PR) إلى ال (TGN) وجود تأثيرات مختلفة لطفرات ال DN) ) المختلفة. وقد كان لطفرة (T72N P-loop) التأثير الأكبر. وكان لها تأثير أيضاً علي توزيع المتراكب البروتيني retromer. وقد أشارت هذه القياسات للوصول إلى حالة مستقرة أكثر منها في تحليل ال (pulse-chase) المستخدم هنا. وبالتالي فقد فحصنا تأثير ال (G429R DN- EHD1) المعرض للطفرة على مسير CD8-M6PRخلال حجيرات آكلات الخلايا في نظام مقالنا هذه.

وفي مقالنا هذا؛ فلم يوصلنا استخدام ال (DN- EHD1) إلى حدوث أي احتباس لل (CD8-M6PR) في الجسيمات البالعة المدوِرة أو المبدئية. وعند مرور 20دقيقة, يتواجد (CD8-M6PR) مع ال (TGN). (PCC = 0.721 +/− 0.134, MCC[sub]STxB[/sub]= 0.743 +/− 0.200 n=4 .. ولم يكن ذلك مختلفاً بصورة كبيرة عنه في عينة الخلايا المتحكم بها. ولم نلاحظ أن خلايا (DN GFP-EHD1) قد ظهرت لتحتل مكان أقل من مجموع (anti-CD8 Ab) كما هو مشار إليه. ولم يظهر ذلك أي تأثير علي ترتيب الترقيم مع ال (TGN). (PCC = 0.721 +/− 0.134, MCC[sub]STxB[/sub]= 0.743 +/− 0.200 n=4 ... وبالمثل؛ فقد تم الحصول علي النتائج -السلبية بالضرورة- مع تركيبة ال (wt EHD1).

وتحدث هذه التركيبات السلبية الغالبة خلال احتباس البروتينات الأخرى المطلوبة. ويستطيع (DN GFP-EHD1 ) أن يبذل تأثيراته علي الحركة العكسية أثناء احتباس (VPS26)، أو أي بروتين مهم أخر في الجسيمات البالعة المدوِرة. وكذلك فقد لاحظنا أن الاضطراب في الحركة الحيوية قد يكون كنتيجة غير مباشرة. وبالفعل؛ يرتبط (SNX1) بشكل طبيعي مع الجسيمات البالعة المدوِرة والمبدئية. ولكن عند الاستخدام المفرط ل GFP-EHD1
(استخدام الكمية الكافية لتشكيل العضيات لأنابيب) فقد أدى ذلك إلى تطويع ال (SNX1) إلى أطراف الدسيمات البالعة المدوِرة. وقد أدي استخدام (GFP-EHD1) إلى تواجد (SNX1) بشكل أكبر مع الجسيمات البالعة المدوِرة المتجمعة. وهكذا فقد كان من الممكن استنتاج أن أثار (DN-GFP-EHD1) على حركة (STxB) قد تم توسطها باحتباس المتراكب البروتيني retromer بها.

ولاختبار مدي الاعتماد المباشر على ال (EHD1). وقد قمنا بإتمام عملية تحلل (EHD1) باستخدام ال (siRNA) في خلايا (BSC-1). ولم يربط  التزاحم البسيط لهذه الخلايا أي نوع معروف من التتابع المستخدم في العينة السلبية المتحكم بها. وبسب تفاعل (EHD1) مع (VPS26 )؛ فمن المحتمل أن يوثر هذا التحلل علي استقرار الأخر. ومن ثم، فقد نفذنا عملية تحلل (VPS26) وقمنا بمراقبة ال (EHD1) و (VPS26) في كلا العمليتين. وقد تم تحديد درجة التحلل باستخدام الصبغة الغربية (beta-tubulin) في العينة المتحكم بها. وقد استنفد (EHD1) بنسبة أكثر من 85% بلا تأثير علي مكون ال retromer  (VPS26). وبالمثل فإن تحلل ال (VPS26) (لم يغير أكثر من 80% التعبير عن ال EHD1). وقد تم قياس الحركة الحيوية العكسية لل STxB) )
بإضافة عناصر الكبريت إليه كما حدث سابقاً. وقد أدي تحلل ال (EDH1) إلى منع الكبرتة 77% +/− 4 (n=3)  مقارنةً بالعينة  المتحكم بها والتي بها تجمعات قليلة نسبياً. وقد اتفقت هذه النتيجة مع نتيجة ال (DN-EHD1)
وبشكل مفاجئ فقد قدم تحلل ال EDH1)) منع عملية الكبرتة بشكل كبير عنها في ال (VPS26). أما واقعياً، فإن نتائج تحلل VPS26 كانت (39% +/−20 (n=3) .. مما قلل من القيمة مقارنةً بما وجدناه نتيجة أبحاثنا. وقد أشار ذلك إلى أن (STxB) و(EHD1) هي مهمة جدًا مقارنةً بمكون ال retromer علي الأقل.

وكما هو مفترض أن البيانات السلبية الغالبة لل (EHD1)، فليس لتحلل ال (EHD1) تأثير ملحوظ على الحركة الحيوية ل (CD8-M6PR).
نشاط مركب الريترومر في عملية توجيه الإندوسومات.
ولأننا رأينا كيف أثر البروتين DN-EHD1 على معالجة الإندوسومات، قررنا مقارنة هذا التأثير بتأثير مركب الريترومر على المرور من خلال قنوات الإندوسومات.
ويعمل بروتين VPS26 على تأخير إيصال المواد المتراجعة، فهو يعطل مركب الريترومر حيث إن كميته لا تكفي للمرور. وقد تم إستخدام Tfn لتصنيف الإندوسومات القديمة والمعالَجة. وقد تم تعقب خفقان مادة شجا توكسينB (STxB) في الخلايا لمدة 30دقيقة وكان قياس مادة الشيجا توكسينB(STxB) عند شبكة جولجي (TGN) في الخلايا المتصادمة (PCC = 0.268 +/− 0.125, MCC[sub]STxB[/sub]=0.206 +/−0.101) أقل بكثير (p , 0.0001) من الخلايا غير المتصادمة PCC = 0.570 +/− 0.058, MCC[sub]STxB[/sub]= 0.744 +/− 0.077)تلك النتيجة التي تم توقعها في تجربة الكبريت. كما أن نفاذ بروتين VPS26 يؤدي إلى إعادة توزيع مادة شيجا توكسينB( STxB). ولكي نزود مدى التأثير اعتمدنا على مورفولوجيا الخلايا Bsc- 1. وعادةً ما تحيط شبكة جولجي بالإندوسوم المعالج، لهذا تمكنا من تحديد كمية مادة الشيجا توكسين (STxB) داخل دائرة من مغطاة بشبكة جولجي وتمت مقارنتها بها في باقي الخلية. وقد تم قياس مادة الشيجا توكسين (STxB) الموجوده خارج الدائرة ووُجدت في الإندوسوم القديم 60 +/− 16% (n=4)في الخلايا المتصادمة وهذا مقارنة 19 +/− 12% (n=10) في الخلايا المعالجة غير المتصارعة. وكانت نسبة مادة STxB(p < 0.001) اكثر في الخلايا القديمة منها في الخلايا غير المعالجة (8.8 +/−9.3% (n=4). وتوضح هذه النتيجة عزل كمية كبيرة من الشحنات في في الإندوسوم القديم في ظل غياب مركب الريترومر الفعال. كما أن معالجة الترانسفيرين لا تتأثر بإصطدام بروتين VPS26. وقد فحصنا بعد ذلك مدي تأثير VPS26 KD على هروب المستقبل الفوسفاتي CD8-M6. ولا شك في أننا نحتاج إلى VPs26 لوصول CD8-M6PR إلي شبكة جولجي ولكن كان تركيزنا على ما إذا كانت ستتأخر الشحنات في في الإندوسومات القديمة أو الجديدة أم لا. وقد تم تعقب خفقان ال anti-CD8-M6PR  لمدة 30 دقيقة كما حدث مع مادة STXB. وباستخدام القياس المركزي وُجد أن ما يُقدر ب 90 +/− 10% (n=6) من anti-CD8-M6PRقد تأخر في الإندوسوم القديم مقارنة ب  20 +/− 10% (n=6)  في الخلايا التي تحت السيطرة. وقد وُجد أن المستقبل الفوسفاتي  CD8-M6PR في الإندوسوم القديم تداخل مع مادة الترانسفيرين (Tfn) بدرجة أكبر في محيط الخلية وبدرجة أقل في مركز الخلية. وهذا يوضح أن مركب الريترومر مطلوب للخروج من الإندوسوم القديم. وهذه النتيجة تشبه تلك النتيجة التي حصل عليها آخرون من خلال تتبع المستقبل الفوسفاتي CI-M6PRواصطدامه مع SNX1 . كلا النتيجتين توضحا أن بروتين VPS26  مهم لمرور شحنات STxB  وCD8-M6PR من الإندوسوم القديم والمعالج.
معالجة مركب الريترومر للشحنات الموجودة في الإندوسومات القديمة.
ويتم استعمال مركب الريترومر في الأغشية التي تحتوي على شحنات متراجعة من خلال نشاط Rab5  وRab7  في الإندوسومات القديمة. وقد وجدنا أن خفقان الشحنات التي يسيطر عليها مركب الريترومر أحدثت تغيراً في توزيع مركب الريترومر المستعمل في الممر الذي يتوسطه الريترومر. وقد تم تصور حركة SNX1  من بيئة الإندوسومات إلى منطقة جوكستانوكلير. ورغم أننا لم نتعرف على الإرتباط مع الإندوسوم المُعالج لكننا هنا ركزنا على إعادة توزيع مركب الريترومر كممر للمرور من خلال الإندوسوم المُعالج. وقد أُستخدمت مادة STxB لتطبيقها على سطح الخلية بينما تظهر CD8-M6PR من خلال الممر في حالة مستقرة. وقد اطلقنا رمز  BSC-1على كل من SNX1  وVPS35  وذلك لأن مركب STxB  تحرك من الإندوسوم القديم (2.5) دقيقة إلى الإندوسوم المُعالج(7) دقيقة وإلى الشبكة الجولجية في 30 دقيقة. وفي غياب STxB  يتم إعادة توزيع مركب الريترومر في كل من منطقة بونكتا وجوكستانوكلير. وقد تم استدعاء كل من VPS35 وSNX1إلى الإندوسوم القديم وقد تداخل مع STxB  بعد 2.5دقيقة. وبعد 7دقائق تداخل SNX1  بنسبة  (p < 0.001) مع STxB  وذلك لأنه مر من خلال الإندوسوم القديم. وفي خلال 30دقيقة كانت مادة STxB  عند أجسام جولجي ولم يعد كلا منSNX1  وVPS35 يتداخل مع STxB  . ولم يُلاحظ مركب الريترومر في شبكة جولجي وهذا يوضح مرور مركب الريترومر مع مادة STxB  من الإندوسوم القديم إلى المُعالج.  
بحث.
لا تأخذ جميع الشحنات المتأخرة نفس الطريق من غشاء البلازما إلى شبكة جولجي، فقد وُجد أن الشحنات التابعة لمركًب الريترومر مثل CD8-M6PR وTGN38  وSTxB تمر بشكل متعاقب من غشاء البلازما إلى الإندوسومات القديمة أو المعالجة ثم إلى شبكة جولجي وذلك بالرغم من أن الدرجة التي يمر بها من خلال الإندوسوم المُعالج كانت مثيرة للجدل. كما يعمل المستقبل الفوسفاتيM6PR  على توصيل ( lysosomal hydrolases ) إلى الإندوسومات المتأخرة ويتم استعادته مع  Rab9 وTip47   إلى شبكة جولجي. ويتطلب العبور المتأخر لTGN38  إلى  (Golgin GCC88)بينما تحتاج مادة STxB  للوصول إلى (Golgin GCC185).
وعلى الرغم من تلك الدراسات الدقيقة التي أُجريت من أجل إيصال الشحنات إلا أنه ليس واضحاً أي من أجزاء الإندوسومات ذات أهية فسيولوجية لكل شحنة. وقد أوضح كلا من Mukhodpadhyay  وLinstedt أن عدم نشاط (GPP130) من خلال إضافة (Mn[sup]++[/sup]) لبقاء مادة STxB في البناء الإندوسومالي موزعة في سيتوبلازم الخلايا هيلا. وفي هذه لحالة يتم إعادة توجيه مادة STxB  في مسار الإندوسومال المتأخر مما يشير إلى أن GPP130 تعمل داخل الإندوسوم القديم وقد أوضح البعض أنه بسبب وجود مركب الريترومر في الإندوسومات القديمة فإن  مركب الريترومر يتدفق مباشرة من الإندوسوم القديم إلى شبكة جولجي متجنباً كل من الإندوسومات المتأخرة والمُعالجة. ومن الناحية الاخرى وُجد أن مادة STxB  تداخل مع الإندوسومات القديمة أثناء المرور المتأخر في خلايا هيلا، زلكنه لم نستطيع اكتشاف نسبة مرور مادة STxB  من الإندوسومات القديمة. ولم يكتشف Lieu et Al عبور سائل WT TGN38 من خلال الإندوسومات المُعالجة بينما لاحظ Ghosh et Al. عبور مادة tac-TGN38 من خلال الإندوسومات المُعالجة. ويمكن أن نجد بعض الإختلافات البسيطة التي ترجع إلي الاختلاف البسيط الذي يوجد بين الإندوسومات القديمة والمُعالجة في خلايا هيلا. وتشير النتائج التي توصلنا إليها أن الخلايا BSC-1 التي تم التعرف عليها في الإندوسومات القديمة والمُعالجة توضح أن حركة المرور التابعة لمركب الريترومر من خلال النظام الإندوسومالي يحتاج إلى الإندوسوم المُعالج والإندوسوم القديم أيضاً. لقد استطعنا فحص هذه الممرات والأجزاء التي يتضمنها من خلال اتباع اثنين من شحنات مركب الريترومر في الإندوسومات.
وقد استطعنا من خلال هذه الدراسة التعرف على الإندوسومات القديمة مثل  EEA-1 الإيجابي و EHD1 السلبي وRab11a السلبي. كما أنه تم التعرف على الإندوسومات المُعالجة مثل  EEA-1 السلبي و EHD1 الإيجابي Rab11a. وقد تمييز كلاهما عن TGN46  الإيجابي وTGN وGM130 الإيجابي في خلايا BSC-1  المُستعملة هنا.  
مرور مركب الريترومر من خلال الإندوسوم المُعالج
لقد لاحظنا أن كل من مادة STxB  والمستقبل الفوسفاتي CD8-M6PR يمرا من خلال الإندوسوم المُعالج أثناء المرور المتأخر. ولأن هدفنا كان مركّزاً على المرور المتأخر في غشاء البلازما لم يتم التركيز على عبور CD8-M6PR من الإندوسوم القديم. وبالرغم من أن مركب الريترومر هو مركّب ضروري لوصول هذه الشحنات إلى شبكة جولجي إلا أن الحركة التابعة لمركب الريترومر في الإندوسوم القديم لا تعني الوصول المباشر إلى شبكة جولجي. وعن طريق تحليل متابعة الخفقان لاحظنا مرور مادة STxB  و CD8-M6PR بشكل متعاقب من الإندوسوم القديم إلى الإندوسوم المُعالج ثم إلى شبكة جولجي. وكنا قادرين على متابعة تلك الشحنات في الإندوسوم المُعالج من خلال إدخال مادة الترنسفيرين (Tfn) لمدة 25دقيقة أو أستعمال بعض المواد الإندوسومالية مثل Rab11a وGFP-EHD1. ويبدو أن الملاحظة أظهرت أن التداخل في الإندوسوم المُعالج قد سبق التداخل في الشحنات إلى شبكة جولجي. هذه الملاحظات توضح أن جزءاً كبيراً من حركة مركب الريترومر تمر من خلال الإندوسوم المُعالج.
ولا يزال الأمر غامضاً ما إذا كان المرور من خلال الإندوسوم المُعالج مهماً من الناحية الفسيولوجية مهماً ام لا. لذلك تناولنا هذه المسألة عن طريق أزالة الإندوسوم المُعالج. وقد أًستخدم في إزالة الإندوسوم المُعالج نظامHRP-DAB  في عدد من خطوط الخلايا المختلفة دون التأثير على مرور الترانسيفيرين الإندوسومالي أو حركة المرور المتأخرة التي لا تمر من خلال الإندوسوم المُعالج. ويختلف هذا النظام عن الذي يستخدمه Stoorvogel في إستخدام قياس الوقت عن طرق النبض للإشارة إلى الإندوسوم المُعالج. لقد أكدنا على الخصوصية من خلال إظهار أن المرور المُعالج من خلال الإندوسوم القديم إلى الممر الإندوسومي والليزومالي ثم إلى شبكة جولجي عن طريق الإندوسومات القديمة يظل ذو أهمية. وفي حال عدم إمكانية إستخدام الإندوسوم المُعالج لم تتمكن كل من مادة  STxB وCD8-M6PR في الإندوسوم القديم من الوصول إلى جهاز جولجي وتم تحويل الشحنات إلى حجرة أخرى. ومن الغريب أن نجد عدم عمل الإندوسوم المُعالج لا يؤدي إلى تسريب مادة STxB  او CD8-M6PR في الإندوسوم القديم مما يدعم فكرة أن إفراز الإندوسومات القديم والممرات المتأخرة قد حدثت بالفعل عندما تم تحويل الشحنات عن طريق إزالة الإندوسوم.
التفسير الأبسط لنتائجنا هي أن جزء كبير من حركة المرور التابعة لمركّب الريترومر تمر من خلال الإندوسوم المُعالج ولا يمكن تجاوزه. وهناك تفسير يوضح أن مركب الريترومر لم يتمكن من اداء عمله عند أيقاف الأندوسوم المُعالج إلا أن هذا التفسير غير مُحتمل لأن عدم نشاط مركب الريترومر يؤدي إلى عدم القدرة على فرز الشحنات التي تخرج من الإندوسوم القديم. وقد وجدنا أن مركب الريترومر قد تم توجيهه إلى حجرة ضالة بمشاركة STxB  مما يوضح أن إيصال الشحنات لم يُمنع بسبب نقص مركب الريترومر ولكن بسبب عدم القدرة على الوصول إلى المكان الصحيح.
مادة ال EHD1 والمرور المتأخر
لقد ارتبطت مادة EHD1  فيزيائياً بالإندوسوم المُعالج. وهو ضروري لمعالجة الترانسفيرين. وهو يتفاعل بشكل مباشر مع VPS26 في مركب الريترومر. وهذا التفاعل غامض وذلك لأنه وُجد أن مركب الريترومر يقع بشكل رئيسي في الإندوسومات القديمة. فإذا كان يعمل مركب الريترومر على توجيه المرور بشكل مباسر من الإندوسوم القديم إلى شبكة جولوجي، فإنه من الصعب معرفة كيفية حدوث التفاعل مع EHD1  في الإندوسوم المُعالج. وقد لاحظنا مرور الشحنات التابعة لمركّب الريترومر في الإندوسوم المُعالج وقد عمل DN EHD1 على إعادة توزيع مركّب الريترومر في الإندوسوم المُعالج. ويوضح هذا أن التفاعل بين مركّب الريترومر وEHD1  لأنهما يمران من خلال الإندوسوم المُعالج.
ويؤدي اصطدام EHD1 إلى حجز مادة STxB  في الإندوسوم المُعالج. وبما أن القليل من هذه المادة تذهب إلى شبكة جولجي، فهذا دليل على أن المسار من خلال الإندوسوم المعالج هو المسار الوحيد لمرور STxB .
وكان عدم تأثير اصطدام DN-EHD1 وEHD1 صادماً. وقد لاحظ Gokool et Al بطئ مرور CD8-M6PR  إلى  شبكة جولجي باستخدام  P-loop mutant ل  EHD1.  ونحن لسنا متأكديم من سبب هذا الإختلاف. وربما يرجع هذا الإختلاف إلى اختلاف حالات التجربة. وقد لاحظ Gokeel et Al عائقاً عند درجة حرارة  32° وليس عند درجة حرارة 37°. وقد كان عملنا في ظل درجة حرارة 37°. ولم يلاحظ  Gokool et Al ولا نحن أى تغيراً في المرور تحت درجة الحرارة تلك. وقد أدي اصطدام EHD1 إلى إنخفاض في إفراز المضاد anti-CD8. وربما يعكس هذا تغييراً في إيصال  CD8-M6PRإلى سطح الخلية. ولم تهتم تجربتنا بإصال شحنات M6PR إلى الإندوسومات المتأخرة بالرغم من أن المرور لا يُعتقد بأنه مرور EHD1 . وتشير دراستنا إلى أن CD8-M6PR أقل اعتماداً على عمل EHD1 من STxB
مركب الريترومر في المسار المتأخر
لقد ارتبط مركب الريترومر بالعديد من الوظائف. لقد ارتبط بالمرور من الإندوسوم القديم إلى منطقة جولجي حيث يعمل على استرجاع  الM6PR من الإندوسومات المتأخرة إلى منطقة جولجي. وتوضح النتائج التي توصلنا إليها أن أحد مهام مركب الريترومر تتمثل في توجيه الحركة من الإندوسومات القديمة إلى الإندوسومات المعالجة. وقد دعم تطويع مركب الريترومر إلى الإندوسومات القديمة هذا الرأي. وقد عمل VPS26  على إبطاء حركة المرور في الإندوسومات كما عملت على عزل الشحنات في الإندوسوم القديم. ويشبه هذا الإسلوب الإسلوب الذي تم ملاحظته عند اصطدام EHD3 وهو البروتين الذي نحتاجه للعبور من الإندوسوم القديم إلى المُعالج. ولأن مادة p150[sup]glued[/sup] تتفاعل مع أيضاً مع Rab6IP1 فقد أتضح أن الشحنات التابعة لمركب الريترومر تعبر مباشرة من من الإندوسوم القديم إلى شبكة جولجي ومع ذلك تم العثور على Rab6IP1 في الإندوسومات المُعالجة حيث يتفاعل مع Rab11a وهو ضروري لمُعالجة الترانسفيرين. وتقع الإندوسومات المُعالجة في منطقة MTOC (نهاية الأنابيب الدقيقة) وهو هدف ممكن لحركة المرور الموجهة. وفي ضوء النتائج التي توصلنا إليها يبدو واضحاً أن حركة المرور لمركب الريترومر من الإندوسوم القديم تصل إلى الإندوسوم المُعالج.
ولا يساوي إخماد الإندوسوم المُعالج ظاهرياً إصطدام VPS26. والخروج من الإندوسوم القديم يحتاج إلى مركب الريترومر حيث أن إيقاف الإندوسوم المُعالج يضلل المرور بعد الخروج من الإندوسوم القديم. وهذا يعني الخروج التابع لمركب الريترومر حدث بالفعل في الحالة الخيرة وقد لاحظنا أيضاً أنه في الخلايا غير النشطة يظل مركب الريترومر متصلاً بالشحنات في جزء مستقل مما يعني أنها لم تصل إلى المرحلة التي تستطيع فيها إطلاق الشحنات. وهذا يعني أن مركب الريترومر يعمل على تسهيل خروج الشحنات المتأخرة من الإندوسوم القديم ويظل مرتبطاً بتلك الشحنات حتي الإندوسوم المُعالج، لكن من الصعب أن تقول من هذه النتائج ما إذا كان يساهم مركب الريترومر في إيصال الشحنات من الإندوسوم المُعالج إلى شبكة جولجي أم لا.
هل هناك طريق مباشر من الإندوسوم القديم إلى شبكة جولجي؟
ولا يستثني عملنا وجود مسار مباشر من الإندوسوم القديم إلى شبكة جولجي. قد يكون هذا المسار موجود في الخلايا الأخرى أو يشمل شحنات أخرى في خلايا BSC-1. وقد وجدنا أنه في خلايا BSC-1 أن معظم الشحنات التابعة لمركب الرترومر يجب أن تمر من خلال الإندوسوم المُعالج.
ولا تتفق النتائج التي توصلنا إليها مع تلك التي توصل إليها آخرون أن الشحنات يمكن أن تمر مباشرة من الإندوسوم القديم إلى شبكة جولجي. وفي ضوء النتائج التي توصلنا إليها أنه من العقل أن نعيد النظر في تلك النتائج. وقد تم العثور على زوجين من الشحنات التابعة لمركب الرترومر أثناء ذهابهما إلى بروتين Rab6IP1 في شبكة جولجي ولكن وُجد هذا البروتين أيضاً في الإندوسوم المُعالج لذلك لا يُستبعد المرور من خلال هذا الإندوسوم. ويحتاج كل من Rme8 ومركّب الرترومر وSNX8 إلى عبور العديد من الشحنات بين الإندوسوم القديم وشبكة جولجي. ولكن عند الوصول إلى النهاية لا نعرف ما إذا كان يتم المرور من خلال الإندوسوم المُعالج أم لا. ويتم استدعاء مركب الرترومر إلى الإندوسوم القديم وهو ضروري وهو ضروري لإيصال الشحنات إلى شبكة جولجي. ويشير مشاركة مركب الريترومر في الإندوسوم القديم وفي شبكة جولجي إلى وجود مسار مباشر في مجموعة متنوعة من النظم. ورغم أنه لا يمكن استبعاد هذا المسار في هذه النظم إلا أنه لم يظهر المسار الجانبي للإندوسوم المُعالج في الكائنات و الخلايا الأخرى.
نموذج للنقل التقامي لمركّب الريترومر
وتتيح المعلومات التي لدينا بدمج الدور التي تقوم به الإندوسومات المُعالجة في مسارات ثابتة. وقد اقترحنا نموذجاً نوضح فيه مرور مادة ال STxB وCD8-M6PR من خلال 3 مراحل مختلفة. في المرحلة الأولى يتم توصيل الشحنات المتأخرة والمُعالجة والهادمة إلى الإندوسوم القديم. ويدعم هذا مجموعة واسعة من العلماء. والوصول إلى الإندوسوم القديم في هذه الحالة يعكس الضوء على الحركة القادمة من غشاء البلازما. 
وتشمل المرحلة الثانية الخروج من الإندوسومات القديمة وهناك على الأٌقل 4 مسارات للخروج من الإندوسومات القديمة. والشحنات الأولى التي تخرج مثل الفورين تخرج في المسار الحويصلي الذي ينضج في الأندوسوم القديم.
والمسار الثاني هو المسار الذي يعود إلى غشاء البلازما والمسار الثالث يؤدي إلى الإندوسوم المُعالج الذي يتضح من خلال المستقبل الترانسفيريني. والمسار الرابع هو هو خروج مادة STxB وCD8-M6PR المرتبطة بمركب الريترومرمما يوفر مسارين منفصلين للإندوسوم المُعالج والديل على هذا هو توزيع مادة STxB وCD8-M6PR  الموجودة في الإندوسومات القديمة عند اصطدام VPS26  وكذلك لاحظنا انفصال مادةSTxB وCD8-M6PR  من الإندوسوم القديم عند إيقاف نشاط الإندوسوم المُعالج. إننا لم نوضح مساراً مباشراً من الإندوسوم القديم إلى شبكة جولجي في هذا النموذج لأنه لا يوجد لدينا معلومات تثبت وجوده رغم إمكانية وجوده.
وأخيراً المسار الذي يؤدي إلى شبكة جولجي من الإندوسوم المُعالج، وهما طريقين أحدهم تابع ل EHD1  ويمكن أن تضح العديد من الأمور الصعبة عند مرور الإندوسوم المُعالج من هذا الطريق. وإذا شمل مركب  الرترومر الذي يخرج إلى الإندوسوم القديم كل الشحنتين فإنه من الصعب معرفة الإختلاف في تبعية EHD1  ومع ذلك إذا وصل مركب الرترومر إلى الإندوسوم المُعالج فربما يوجد مسارين منفصلين لكل من الشحنتين من الإندوسوم المُعالج إلى شبكة جولجين. وربما يفسر لنا اللجوء إلى الإندوسوم المُعالج كيفية تفاعل الإندوسوم المُعالج المرتبط ببروتين EHD1  مع الإندوسوم القديم في استدعاء مركّب الرترومر لعبور مادة STxB. ولا نستبعد مشاركة مركّب الرترومر في مرحلة المرور من الإندوسوم المُعالج إلى شبكة جولجي. وتفسر لنا المسارات المتشعبة الإعتماد المختلف لكل من TGN38  وSTxB على GCC88  وGCC185  على التوالي للوصول إلى شبكة جولجي.
وقد اكتشفنا أن النماذج المختلفة من مركّب الرترومرمع أنواع مختلفة من مركّب النيكسين يؤدي إلى ظهور شحننات مختلفة من الإندوسوم القديم إلى شبكة جولجي. ويمكن لهذا أن يحدث أيضاً عند الخروج من الإندوسوم القديم إلى الإندوسوم المُعالج. ونظراً للتعقيد المتزايد في النظام الإندوسومالي فليس مدهشاً أن نجد العديد من المسارات الأخرى لشحنات مختلفة.
المواد والأساليب
استزراع الخلايا
وقد تم استزراع الخلايا BSC-1 القادمة من مختبر ميلمان في المحيط الأساسي ومعها ما يقدر بنسبة 10% البوفينزيروم الجنيني و1% أحماض امينية غير ضرورية و1% من بيروفات الصوديوم و1% من البنسلين و5% من ثاني أكسيد الكربون و95% هواء. وقد تم زرع خلايا هيلا ATCC كما هو موضح. وعند استخدام الترنسفيرين، أُصيبت الخلايا بالغدة الدرقية.
الأجسام المضادة والمواد الكاشفة.
وكانت المواد المضادة التي تم استخدامها على النحو التالي: mouse anti-LAMP1  وmouse anti-LAMP2 و mouse anti-EEA-1 وmouse anti-GM130و mouse anti-PDI وpolyclonal rabbit anti-Rab11  وmouse anti-SNX1. والمواد المضدة الثانوية المستخدمة كانت mouse anti-SNX1 وanti-sheep IgG . وقد تم استخدام مادة STxB  مع استخدام Alexa Fluor 546 وذلك وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وقد استخدمت مادة HRP المرتبطة بالترنسفيرين البشري أو غير المرتبطة به ف تجربة الإندوسوم غير النشط. كما استخدم 70 kDa FITC لمتابعة مرحلة الالتقام.
استعمال مادة STxB والترانسفيرين والديكستران
لقد تم زرع خلايا BSC-1 على شريحة تحت الميكروسوكوب. قد أُصيبت الخلايا بالترانسيفرين المُصاب في تجربة امتصاص الترانسفيرين. وفي يوم الإستخدام تم احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37درجة مئوية وذلك لظهور مادة الترانسفيرين من الخلايا. وقد تم تبريد الخلايا في جميع التجارب. وقد تم الدمج عن طريق وضع الخلايا في درجة 37° لمدة من الوقت.
إيقاف عمل الإندوسوم المُعالج
لقد تم إيقاف عمل الإندوسوم المُعالج بإستخدام الترانسفيرين  HRP كما ذكرنا سابقاً. لقد اتصلت خلايا  BSC-1بالترانسفيرين تحت درجة برودة لمدة 45دقيقة. وقد تداخلت الروابط مع المكمل MEM  لمدة 30دقيقة عند 37 درجة مئوية. وبالرغم أن الوقت المستغرق أكثر من 25دقيقة إلا أنه يؤكد أن الترانسفيرين قد عمل على إظهار الإندوسوم القديم. وقد تم إزالة سطح الترانسفرين المتبقي ب pH 5.0 لمدة 5 دقائق يليها الغسل ب  pH 5.0  لمدة 5دقائق في درجة حرارة منخفضة. وقد تعرضت الخلايا الزائفة الوهمية لنفس تلك الظروف مع استخدام مادة الترانسفيرين دون HRP . وُضعت الخلايا في درجة برودة عالية وتم غسلها PBS[sup]++[/sup]ثلاث مرات. لقد وُضعت الخلايا في مادة PBS لمدة ساعة في درجة حرارة منخفضة في الظلام. وبعد إيقاف التفاعل معPBS  اتصلت مادة STxB بالخلايا في درجة برودة عالية ثم بعد ذلك بدأ الإستعداد للتداخل. وبالنسبة لمادة الترنسفيرين Alexa 488 فقد سُمح لها بالتداخل مع الخلايا لمدة 30دقيقة. وبالنسبة لإمتصاص مادة الديكستران فقد تداخلت الخلايا مع FITC-dextran عند درجة 37° ثم غسلها ومطاردتها لمدة 60دقيقة. وقد اُستخدمت مادة  LysoTracker[sup]™[/sup] Red لمدة 10دقائق لتمييز اللزومات. وقد استقرت الخلايا بعد ذلك بنسبة 3% ثم ظهرت.
تجربة استخدام الفورين
إن تداخل مادة Full-length furinمع Flag (Sigma) epitope في نهاية منطقة الC  كان إكتشافاً جيداً من قِبل Gary Thomas. لقد تحولت مادة ال Flag-furin إلى pCDNA3 . لقد أُصيب الهيكل بخلايا BSC-1 بإستخدام  Lipofectamine LTX في الحمض النووي 10 μL per μg . وفي نفس الوقت أٌضيف الفيروس الغددي الذي يحتوي على المستقبل hTfn  إلى الخلية المزروعة. وبعد 24 ساعة تمت عملية التداخل كما وصفها  Chia et. Al. لقد توقفت الإندوسومات المُعالجة عن العمل في بعض الخلايا كما تم توضيح ذلك سابقاً قبل تداخل الروابط. وقد تم تطبيق  Rabbit anti-Flag Ab  على الخلايا في درجة حرارة منخفضة لمدة 45 دقيقة. وبعد الغسل في PBS تم تداخل ال Rabbit anti-Flag Ab لمدة 60 دقيقة تحت درجة حرارة 37°. وخلال اخر 5 دقائق من التداخل تم إضافة الترانسفيرين Alexa-488  لتأكيد ان الخلايا الفردية أوقفت عمل الإندوسومات المعالجة. 
كبرتة مادة STxB
لقد تم إجراء تحليل الكبرتة لمادة STxB-SS كما هو موضح. وبإيجاز قد أُصيبت خلايا BSC-1 بEHD1 أوEHD1 قبل 72من العلاج. وقد أُصيبت خلايا BSC-1مرة واحدة لمدة 3 أيام Lonza Nucleofection[sup]™[/sup]وKit V  وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة. لقد تم إذابة الخلايا لمدة 2ساعة في مادة الكبريتات. وقد أَضيف 0.01ميلى جرام من مادة  STxB-SS و0.15 mCi لكل 10سم من الخلايا لمدة 60دقيقة. وقد أدى ذلك إلى موجة واحدة من التداخل. لقد كانت الخلايا متحللة ملطخة بالكوماسي الأزرق والبروتين.
تركيب الحمض النووي
لقد زودنا بارث جرانت بجامعة روتجيرث بكل من EHD1 وGFP-mRme-1 وGFP-mRme-1. ويُشار إلى البنية بEHD1 وDN EHD1على التوالي لتسهيل معرفة الأسماء. وتم إعداد وتنقية مادة STxB و STxB-SS بعد أن قُدمت كهدية من قِبل  Ludger Johannes. كما قدم Matthew Seaman  في معهد كامبردج مادة CD8-M6PR للبحث الطبي.
تحليل الصور
لقد تم الحصول على جميع الصور من خلال مجهر مجهز بعدسة 63X  وكاميرا  Hamamatsu ER تُدار من خلال مختبر متصل بجهاز كمبيوتر يدار من خلال تطبيق. وقد تم الحصول على الصور ذات العرض العالي والمنخفض للخلايا. تم تحسين البرامج من خلال استخدام برامج الفوتوشوب باستخدام جهاز الحاسب الآلي. وكانت كل صورة تتكون من صور صغيرة منفصلة تم التقاطها في قنوات مختلفة داخل مجال المجهر. وقد تم تحسين التباين الموجود داخل كل صورة لقناة باستخدام أدوات خطية في برنامج الفوتوشوب. ولمنع دخول الخلفية من خارج تركيز الضوء والألوان المنتشرة خضعت صور بحجم 1344 من 1024 بيكسل لمرشح متوسط يعمل بشعاع 14بيكسل للإندوسومات الصغيرة و36 بيكسل للإندوسومات الأكبر. وقد أنفصلت الصورة التي تمت تنقيتها من الصورة الأصلية لإنتاج صورة تظهر فيها البنية الجولجية والإندوسومالية على خلفية سوداء. وهذا يقلل من التداخل الزائف المبني على صور منخفضة الكفاءة. ويتركب كل زوج من الصور الأحمر/الأخضر والأحمر/الأزرق والأزرق/الأخضرفي برنامج Volocity. وقد تم قياس الخلايا الفردية في كل زوج باستخدام معامل ارتباط بيرسونس المعدل (PCC) ومعامل ارتباط ماندر (MCC). ويعمل (PCC) المعدل على قياس جميع وحدات البيكسل داخل الصورة ويتجاهل وحدات البيكسل التي تكون قيمتها صفر وذلك لتجنب التزييف المبني على القنوات التي قيمتها صفر. ويظل PCC دقيقاً تجاه الإختلاف لكل قناة في الهيكل. وقد انقسم قيم PCC من الصور المجمعة  إلى 3 فئات هما 0-0.25 وبدون قيمة و0.26-0.4 و 0.41-1.0. وبالنسبة لحساب MCC فالقيمة القصوى لكل صورة تم قياسها، والبداية تبدأ ب 10% من القيمة القصوى في الصورة. MCC هو مجموع وحادت البيكسل على البداية لكلتا القناتين. وبالتالي يكون MCCSTxB من البكسيلات الموجبة لSTxB التي تداخل مع العلامات الاخرى. وقد انقسم قيم MCCمن الصور المجمعة إلى 3 فئات هما 0-0.2 وبدون تداخل و0.21-0.5 تداخل جزئي و0.41-1.0. وقد تم حساب الفروق في القياسات من خلال قيم PCC باستخدام اختبار t. وقد اتبعت الحسابات المبنية على قيم MCC تلك التي تم حسابها من خلال PCC ولكن لم تظهر.