تأثير عمليات إعادة التدوير الثلاثى و التوافر البيولوجى للفلافونويدات

التدوير الثلاثي وتأثيراته علي الفينوليات



تعريف مختصر :
يلعب نظام إعادة التدوير الثلاثى ( الكبدى والمعوى و الأعتيادي ) دورا ًهاما ًفي التحكم في عملية التخلص من الفينوليات مثل المركبات النباتية مما يؤدى إلى إنخفاض التوافر البيولوجى، ولكن التوافر البيولوجى للقناة الهضمية مرتفع وأطول مما هو متوقع لأنصاف الأعمار للبلازما الظاهرية ، وتهدف الدراسة الحالية إلى التحقق من عملية الترابط بين هذه المخططات باستخدام نموذج الفلافونويد تيلانين النشطة بيولوجيا ً ونموذج رباعي لأمعاء الفئران في وجود أو عدم وجود إنزيم الكرليسترول منخفض المستوى و المثبط جلوكونلاكيتون أو جلوكورنيداز مثبط ساكارولاكتون، وأظهرت النتائج أن التيلانين يمكن أن يُحدث عملية استقلاب لتيلانين جلوركورونيد وأكاسيتين و جلوكورونيد أكاسيتين والتى يتم إفارزها من المرارة وسائل الأرواء المعوى (فى أعلى الأثنى عشر وأدنى القولون ) وخفض جلوكونولاكتون (20 ملم) بشكل كبير من امتصاص التيلانين ومن الافرازات المعوية والمرارية من جلوكورونيد أكاسيتين، وتخفض ساشارولاكتون (1. ملم ) دون أي عوامل أو فى تركيبة من جلوكونولاكتون أيضا ً بشكل كبير في إفراز المرارة وإفراز الأمعاء من جلوكورونيد أكاسيتين فيتحلل أكاسيتين الجلوكورونيدات من المرارة أو سائل الأرواء المعوي بسرعة من قِبل جلوكورنيداز البكتتيريا والأكاسيتين وذلك يتيح إعادة التدوير المعوي، وعلاوة على ذك فإن إنزيم ساكارولاكتوز الحساس و ديكونجوغاتيون جلوكورونيد، وهو الذي يعد أكثر نشاطا ً في الأمعاء الدقيقة عن نشاطه فى القولون، يشير هذا إلى وجود أصل معوي صغير من إنزيم ديكونجاغاتيون ، ويدعم وجود خطة إعادة التدوير المحلية،  فى النهاية أظهرت الدراسة أن إعادة التدوير الثلاثية من الفينول النشط بيولوجيا مثل نموذج الفلافونويد من المكن أن يكون لها تأثير على موقع ومدة البوليفينول الدوائية فى جسم الكائن الحى .
 
المقدمة
 
أثبتت مخططات إعادة التدوير أنها تشارك فى التخلص من الفينوليات بما في ذلك البوليفينول مثل الفلافونويدات (1.2) ، وتعد إعادة التدوير المعوي والكبدي و الإعتيادي هى ثلاثة مخططات تساعد فى التخلص من الفلافونويدات والتى يتم تفعيلها من خلال الإنزيمات المتزامنة فى المرحلة الثانية ( مثل إنزيم جلوكورونيدس ) وتدفق الأكسجين فى الأمعاء والكبد  ومن خلال هذه المخططات يفرز إنزيم ديكونجاكاتد في أشكال أغليكون خاصة بها والخطوة التالية هي استيعاب الأمعاء (3.4)،  تعتبر إعادة التدوير الكبدي والتي أثبتت منذ أكثر من نصف قرن (5) ، أنها تنطوى على إفراز الكبد من الجلوكورنيدات فى الأمعاء عن طريق المرارة و يمكن تحلل الفلافونويد جلوكورونيدات بواسطة غلوكورونيداز مشتق من البكتريا وإعادة إمتصاصها من قِبل القولون ، وبالتالي إكمال إعادة التدوير المعوي  وهذا يختلف عن إعادة التدوير الكبدى ، حيث إفراز الجلوكورنيدات من الأمعاء بدلا من الكبد وهذا مطلوب لإعادة التدوير المعوي والإعتيادي ، وتم اكتشاف إعادة التدوير المعوي من عشر سنوات ، ويحتاج إلى بكتريا غلوكورونيداسيس في القولون لإطلاق سراح أغليكونيس مقارنة بالذى تم إفرازه والجدير بالملاحظة أن إعادة التدوير هو مقترح جديد فى الآونه الاخيرة لا يتطلب سوى جلوكورونيداسيس مشتقة من الخلايا المعوية فى الجلوكورنيدات في الأمعاء الدقيقة العليا وبذلك تستكمل إعادة التدوير الاستيعاب وإعادة التدوير دون الإنزيمات البكتيرية .
 
وتعد الفلافونويدات فئة من مركب بوليفينك الطبيعي والتى من الممكن أن تكون موجودة عادة فى النظام الغذائي البشري مثل الفواكه والخضروات والبذور و الأعشاب الطبية وتوجد إتمامات خاصة بمركبات الفلافونويدات لأنها غير سامة ، وتملك نشاط بيولوجى يتراوح بين مضادات الأكسدة ومضادات الأورام ومع ذلك فإن التأثيرات العلاجية لمركبات الفلافونويدات محدودة بشدة بسبب التوافر البيولوجي المنخفض فى جسم الكائن الحى ، وبما أن معظم مركبات الفلافون يتم إمتصاصها بشكل كبير فإن السبب الرئيسي لإنخفاض التوافر البيولوجي عن طريق الفم هي عملية التمثيل الغذائي فى المرحلة الثانية والتي تدار بواسطة أنزيم أدوب-جلوكورونوسيلترانز المتنقل وأنزيم سولت  لأن الأيض فى المرحلة الثانية يتم إفرازه على نطاق واسع فى الأمعاء عن طريق المرارة أو الطريق المباشر ، وعمليات إعادة التدوير الأيضى المذكورة أعلاه  تزيد من التوافر البيولوجى وتطيل عمر البلازما .
 
وعلى غرار الإنسان، فإن أمعاء الفئران تعبر وظيفيا عن إنزيمات الاستقلاب على سبيل المثال (اوغت ،وسولت ) وأيضا ناقلات الأتربة بما فى ذلك مقاومة البروتينات المتعددة المرتبطة بالبروتين وبروتين مقاومة سرطان الثدى، والتي يمكن استخدامها لمحاكاة نقل الأمعاء البشرية . وتم التعرف على نموذج سائل الأرواء لأمعاء الفئران من قبل إدارة الأغذية والعقاقير وتم تطبيقها على نطاق واسع لتقييم إمتصاص المخدرات وأليات التمثيل الغذائي فى جسم الكائن الحى ، واستخدمت الدراسات السابقة نموذج أمعاء الفئران من الاشباع لإقتراح خلط متكرر من الفلافونويد من خلال نظام ثنائى ينطوي على نظام إعادة التدويرالكبدي وإعادة التدوير المعوي ، وهو أمر بالغ الأهمية فى التخلص من الفلافونويدات من الجسم الحي، ويمكن إعادة عملية التدوير الثالثة من خلال إطالة وقت إقامة الفلافونويدات داخل القناة الهضمية مما يسمح لهم أن يكون التعرض الجيد محليا ً على الرغم من توافر بيولوجى ضعيف ، وتحقق العديد من المطبوعات فى برنامج واحد لإعادة تدوين الفينوليات على سبيل المثال تبين أن التخلص من أنزيم البيوكانين أ و إنزيم غليسيتين و وفورمونيتين يخضع لإعادة التدوير الكبدي ، وتم استخدام أبيجيين وبروتين وديدزين وجيينيستين كمركبات كيميائية لإثبات وجود إعادة التدوير المعوي ، فى الآونة الآخيرة  تم استخدام زوج من وجونيين فلافونويد وجلوكسين كمثال جديد لإثبات وجود إعادة التدوير المحلية على الرغم من أن إعادة التدوير المعوي والكبدي كانت معروفة لفترة طويلة من الزمن إلا أن إعادة التدوير الإعتيادية لم تظهر إلا مؤخرا ومع ذلك لم تتمكن أى من التقارير المنشورة التحقيق فى الثلاثه مخططات لإعادة التدوير .
 
وبالتالى ، فى هذا التقرير ، أثبتنا طريقة التعامل فى إعادة التدوير المعوي والكبدي والإعتيادي  من خلال نموذج فلافونويد تيلانين والجزء اللاسكري من الأكاليتين والتى هى مشتقة من جلوكورونيدات على نطاق واسع فى الأمعاء والكبد،  تم اختيار التيلانين لأنه مركب من المركبات النباتية التي جذبت الكثير من الإهتمام لخصائصها المضادة لتصلب الشرايين والخافضة للضغط ومضادات الإختلاج ، وكان هذا الإنزيم معزولا ً من دراكوسيفالوممولدافيكا ويمكن استخدامه لعلاج إرتفاع ضغط الدم بالاضافة إلى ذلك  تم العثور على تيلانين للحد من تشكيل آفه تصلب الشرايين من خلال مثبط إيب كيتاز الناجم عن الأكاسيتين  وتم اختيار الأكاسيتين أيضا ًلأنه طبقا ً للدراسة السابقة فقد أظهر أن الأكاسيتين يعرض البيروكسيداتيف وهو ذلك الإنزيم الذى يحتوى على خصائص مضادة لإنسداد الأوعية ومضادة للسرطان وهى نشطة للغاية ضد الكبد والبروستاتا والرئة والمعدة وخلايا سرطان الثدى  وعلى الأرجح عن طريق تحريض الخلايا .
 
الموارد والأساليب  
 
قدم الدكتور تشينشون وانغ من جماعة شيهيزى فى الصين التيلانين والأكاستين والذى تم شراؤه من شنغهاى من خلال التكنولوجيا الطبية والثنائى من نوع  
(hplc grade , LC /MS / MS)
وتم شراء مجموعة من المركبات الكيميائية من سانت لويس  بالولايات المتحدة مثل ساشارولاكتون وجلوكوز ومسحوق الملح وجلوكونولاكتون ، وكانت جميع الموارد تحليلية المستوى وتم استخدامها كما جاءت.
 
الحيوانات
 
تم الحصول على ذكور الفئران سيراغ داولى البالغين من العمر ( 80 – 110 يوم ) ويبلغ وزنهم 250 إلى 300 جرام من مركز مختبر الحيوانات من جامعة قوانفتشو الصينيى وتم وضع الفئران _كل أربعة فى قفص_ في غرفة تدفق الهواء أحادية الإتجاه تحت الرطوبة النسبية ( 40% - 70 % ) ودرجة حرارة تسيطر عليها (20 درجة – 24 درجة )  و12 ساعة ضوئية / دورة مظلمة، ثم يتم الكشف عن فلافونويدس في الرقم الهديروجينى 6.5 عند العزل التام ،وُضع الإشباع من خلال الأمعاء الدقيقة العليا للفئران مشيرا ً إلى أن تيلانين الغذائية أو الأكاسيتين لم يتم العثور عليهما فى الأمعاء وتم منع الطعام عن الفئران مع إعطائهم مياه قبل يوم من التجربة .
 
جراحة الحيوان


تمت الموافقة على بروتوكول الجراحة الحيوانى المستخدم فى الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات لجامعة قوانفتشو للطب فى الصين، "نحن نقوم بإشباع أربعة أجزاء (الاثنى عشر و الصائم و الدقاق و القولون) من الأمعاء فى وقت واحد مع القناة المرارية وهو تقريبا ً نفس المذكور أعلاه  بإختصار بعد تخدير الفئران ب 1.2 جراك/ك يوريتان ( 50% ) نقوم بتنقية شرائح مختلفة من الأمعاء والقناة المرارية باستخدام الطريقة الموضحة سابقا ً ، أولا ً يتم وضع قنيتين
(واحدة للمدخل وآخرى للمنفذ) في 10 سم بعيدا ً في الاثنى عشر، وتقع بالقرب من المعدة ، ثانيا يتم إدخال قنيتين على بعد 10 سم من طرفي الصائم واللفائفى على التوالى وأخيرا ًيتم وضع قنينة فى مدخل القولون فى الجزء العلوى بالقرب من الأعور، ويتم إدخال قنية منفذ من خلال فتحة الشرج بعد بدء النضح كان الإشباع من قنينة المدخل فى حين كان الإشباع مدفعوعا ًمن قنينة المنفذ إلى أنبوب مع أسيتونتزيل 100% (2ملم) لفرض تغير طبيعته كإنزيم قادرعلى التحلل إلا عندما تم جمع نضح فارغ (لا فلافونويد) (لا أسيتونتريل) .
 
نموذج النضح المعوى للفأر من خلال النقل الاقليمى وتجارب الأيض
 
تم تشبيع أربعة أجزاء من الأمعاء (الاثنى عشر و الصائم و محطة الدقاق و القولون) فى وقت واحد مع نضح للتيلانين باستخدام مضخة التسريب( جهاز هارفارد بجامعة كامبريدج ) بمعدل تدفق 0.168 مل/دقيقة  تم ترشيح اثنين من تركيزات (40 ، 50 ميكرومتر) من تيلانين وبعد فترة غسل لمدة 30 دقيقة  والتي تعتبر فترة تحقق إمتصاص ثابت يتم جمع عينات المرارة والنضح من قنينة المنفذ كل 30 دقيقة  خلال فترة 2.5ساعة .
 
التحلل للتيلانين بواسطة إنزيم كوليسترول منخفض المستوى
 
لتحديد دور إنزيم كوليسترول منخفض المستوى فى تحلل التيلانين فى الأكاسيتين  كان النضح 40 ميكرومتر تيليانين منفرد أو مشترك مع 20 . 40 . 80 مم مثبط كوليسترول منخفض المستوى ( جلوكونولاكتون ) ، علاوة على ذلك  تم جمع عينات الدم من الوريد كل 30 دقيقة خلال فترة 2.5ساعة ، في نهاية التجربة  تم إزالة أربعة أجزاء من الأمعاء مع مسحها من 0.9 % كلوريد صوديم فى درجة 24 مئوية لإزالة المحتويات داخل الأمعاء والقطع طوليا ً وتم الحصول على الغشاء المخاطى عن طريق كشط من شريحة زجاجية ، (ملحوظة تمت هذه التجربة على الجليد لتقليل الخسائر).
 
تجربة التحلل بواسطة جلوكورونيداز
 
وللتحقق ما إذا كان التحلل يمكن أن يتم بأنواع أجزاء لاسكرية من البكتريا المستمدة من جلوكورونيداز  تم تحصين جزء من العينات المعوية و المرارية مع جلوكورونيداز عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات لتحويل الفلافونويدات  إلى أنواع أجزاء لاسكرية خاصة بهم من ناحية أخرى للنظر فى أهمية وجود البكتريالتحلل الجلوكورونيد تم تحصين الأكاسيتين جلوكورونين مع نضح فارغ والتي تم تشريحها وطردها لإزالة البكتريا المعوية .

إفراز أكاسيتين جلوكويورونويد المتأثر بمثبط جلوكورونيداسي

و هذا يكون عن طريق 40 ميكرومتر تيلانين متشبع ب 0.1 مم  أو بدون تشبع مثبط الجلوكورونيداز (ساكارولاكتون) تم تحديد إلى أي مدى سوف يؤثرغلوكورونيدازعلى إفراز غلوكورونيد أكاسيتين.

إفراز أكاسيتين غلوكورونيد المتأثر بمزيج من مثبط غلوكورونيداز ومثبط اللاكتاز فلوريزين هدرولاز

لتحديد كيف أن غلوكورونيداز ومثبطات اللاكتاز فلوريزين هدرولاز عند استخدامها معا ًمن شأنه أن يؤثر على إفراز غلوكورونيد أكاسيتين تم تشبيع 40 ميكرومتر مع  0.1 ملي أو بدونه غلوكورونيداز المانع (ساكارولاكتون) في تركيبة مع 20 مم مثبط لف (غلوكونولاكتون).

إثبات إعادة التدوير الثلاثي (فيما معناه إعادة تدوير إنتيروهيباتيك و إعادة تدوير المعوي واعادة التدوير الإعتيادي) في نموذج التروية والتجارب المائي
 
لإثبات إعادة التدوير إنتيروهيباتيك كانت هناك حاجة إلى دراسات مختبرية تم حضنها مع     غلوكورونيداز β مستمدة من البكتيريا لإثبات التحلل المائي للجلوكورونيد في عمليات إعادة التدوير الأيضي بالإضافة إلى ذلك تم فحص المرارة والإفراز المعوي من تيلانين ومستقلباته في تجربة الأرواء أيضا ً بهدف إثبات إعادة تدويرالمعوية بالإضافة إلى التحلل المائي للجلوكورونيد بواسطة β-غلوكورونيداز المشتقة من البكتيريا  تم دراسة الإفراز المعوي من غلوكورونيد الأكاسيتين في القولون أيضا ًفي وجود مثبط الجلوكورونيداز وأخيرا ً لإثبات إعادة التدوير المحلية ، كان ينبغي التأكيد على أهمية β غلوكورونيداز المعوية ولذلك تم حضن غلوكورونيد مع بيرفوسيت فارغة والتي تم ترشيحها وطردها لإزالة البكتيريا المعوية كما تم أيضا ًفحص إفراز المعوية من غلوكورونيد أكاسيتين في الأمعاء الدقيقة العليا في وجود مثبط الجلوكورونيداز.

إعداد العينات الحيوية


للكشف عن تيلانين ومستقلباته في سائلُ الأرْواء تم إضافة 20 نانوغرام / مل من مادة البروبيوفينون في خليط من سائلُ الأرْواء أسيتونيتريل أو عينة مرارية (1: 2) تم حقن السائل بعد الطرد المركزي في 13,000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة إلى السائل عالي الضغط لتحليله وفيما يتعلق ببلازما الفئران وعينات الغشاء المخاطي تم خلط 20 ميكرولتر من البلازما أو الغشاء المخاطي مع 100 ميكرولتر ميثانول تحتوي على 200 نانومتر التستوستيرون
تم طرد الخليط بالطرد المركزي في 13,000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة و 100 ميكرولتر من السائل تم نقلها إلى أنبوب ذي استخدام واحد وتم تبخيره حتي جفاف تحت تيار من النيتروجين في درجة حرارة الغرفة و أعيد تشكيل البقايا مع 100 ميكرولتر من الميثانول – المياه. (V / V = 1: 1 و من ثم حقنه في UPLC-MS/MS للتحليل)


تحليل سائل عالي الضغط و استخدمت لتأهيل وتقدير بشأن التحديد النوعي و الكمي لتيلانين ومستقلباته وكانت الشروط على النحو التالي: عمود ZORBAX  SB-C18، 5 ميكرون 4.6 × 150 ملم.
المرحلة المتنقلة A، أسيتونتريل 100٪، المرحلة المتنقلة B، 100٪ العازلة المائية (0.1٪، )V /  LC/MSn ) لتيلانين ومستقلباته
V حمض الفورميك، ودرجة الحموضة 2.5). معدل التدفق: 1 مل / دقيقة؛ التدرج : 0 إلى 15.0 دقيقة، 5-35٪ أ، 15.0 إلى 15.5 دقيقة، 35-50٪ أ، 15.5 إلى 16.0 دقيقة، 50-55٪ أ، 16.0 إلى 17.5 دقيقة، 55-70٪ أ، 17.5 إلى 18.5 دقيقة ، 70-10٪ A، 18.5 إلى 19 دقيقة، 10-5٪ A، 19.0 إلى 20 دقيق،، 5-5٪ A؛ الطول الموجي، 330 نانومتر لتيليانين ومستقلباته و IS. وحجم الحقن: 20 ميكرولتر.
تم تحقيق التأين باستخدام التأين إليكتروسبراي في الوضع الإيجابي.

تم تمثيل نفاذية تيلانين بواسطة P * إف والتي تم الحصول عليها كما هو موضح سابقا (6،23). بإيجاز:
P∗eff=1−Cm/Co4Gz                                 

Mab = Qτ(C0 − Cm)
يمثل " P*eff " نفاذية واضحة للمركب الذي هو قياس لكمية الخسارة في سائلُ الأرْواء حيثما يكون Co و Cm تركيزات داخلة و خارجة معدلة لتناسب تدفق المياه باستخدام وزن  العينةعلي التوالي بينما يكون Gz أو رقم
Graetz (Gz= πDL/2Q), هو عامل مقايسة يتضمن  معدل التدفق (Q) و طول الامعاء (L) و معاملات الانتشار (D) لجعل النفاذية بدون أبعاد
تم حساب كميات من تيليانين الممتصة  (Mab) وكميات من غلوكورونيد الأكاسيتين المتجانسة التي تفرز في تجويف الأمعاء (Mmet) كما هو موضح سابقا (7،23) بشكل عام تم التعبير عن  Mab 

Mab = Qτ(C0 − Cm)


حيث τ هي الفاصل الزمني للمعاينة (30 دقيقة)، والمعلمات الأخرى تكون مماثلة لتلك المعرفة في المقياس وضعت كميات من المستقلب: (Mmet)
Mmet = QτCmet

حيث Cmet  هو تركيز الخارج(nmol/mL) من المستقلب لتناسب تدفق المياه
تحليل إحصائي
تم استخدام تحليل التباينِ ذات الاتجاه الواحد مع أو بدون المقارنات التعددية "توكي كرامر" و إختبار الطالب للتقييم بين السيطرة والعلاج
اعتبرت الاختلافات جسيمة عند p <0.05 أو p <0.01
النتيجة
تعريف التيلانين ومستقلباته عن طريق by LC–MS/MS
وسيلة السائل عالي الضغط التي طورت للتيلانين و مستقلباته كان لديها وقت تشغيل من 20 دقيقة وكان نطاق الإستجابة الخطية المختبرة هو 0.3125-80 ميكرومتر (لمجموع 9 تركيزات) مع الحد الأدنى للقياس الكمي (LLOQ) من 0.2 ميكرومتر.
تفحص تسجيلات السائل عالي الضغط و إدارة الموارد البشرية بالإضافة إلي MS2 جنبا ًإلى جنب مع هياكل من تيلانين أكاسيتين و غلوكورونيد كل منها الملفات السائل على الضغط استخدم لفصل و قياس التيلانين و مستقلباته في العينات التجريبية
تصور اللوجات a  و b ....
 تم استخلاص المستقلب في العينات المرارية في 11.94 دقيقة ( : M1تيليانين غلوكورونيد)

استخلاص المستقلب في 16.31 دقيقة (M2) الشكل 1(B.) تم استخدام المسح الطيفي الكتلي عالي الدقة الذي يعمل في وضع أيون إيجابي لتحديد طيف MS  من المستقلب وأظهر M1 أيون شبه جزيئ.
[M + H]+  من  m/z 623.1617 في مسح كامل لكتلة الطفل ( شكل 1c) و جزيئات أيونات في   m/z 447 و 285(الشكل 1d), حيث أن ذلك يشير إلى أن لهم الصيغة الجزيئية( C28H30O16 أو تيليانين-7-غلوكورونيد).
كان تيليانين-7-غلوكورونيد مستقلب جديد لم يتم ذكره مسبقا ً وأظهرت M2 أيون جزيء شبه [M + H]+ ل M/z 461.1069 في المسح الكامل لكتل الأطياف الشكل 1(e) والأيونات الجزئية عند  / m/z 285  (الشكل 1f) مما يدل على أن لهم الصيغة الجزيئية( C22H20O11 أو أكاسيتين-7-غلوكورونيد)
وقد تم تلخيص مرات الاستبقاء بالسائل عالي الضغط و المعايير المرجعية من مطياف الكتلة Q-TOF جنبا إلى جنب في الجدول الأول.

مرات الإستبقاء من تيلانين مستقلباته في تسجيلات السائل عالي الضغط مع بيانات إدارة الموارد البشرية

النقل الإقليمي و استقلاب التيلانين في نموذج الجرذ المعوي

بعد رشه ب 5 او 40 ميكرومتر ميلياني كان إمتصاصه سريعا ً في الاثني عشر و الصائم واللفائفي وكلا ً مما هو أعلى من تلك الموجودة في القولون و في كلا التركيزات وعلاوة على ذلك، لم يكن هناك فرق كبير في القيم P*eff الاثني عشر و الصائم والدقاق بين تركيزات 5 و 40 ميكرومتر( الشكل 2A)و تم العثور على تيلانين ليتم تحويله إلى الأكاسيتين و غلوكورونيد أكاسيتين في أمعاء الفئران (شكل 1 , 2 ) كما وجدت كميات كبيرة من غلوكورونيد الأكاسيتين و أكاسيتين في سائلُ الإِرْواء مع أعلى إفراز في الاثني عشر وأدنى إفراز في القولون الشكل2Cوالمثير للدهشة بالإضافة إلى تيلانين و أكاسيتين و أكاسيتين غلوكورونيد تم أيضا اكتشاف كمية صغيرة من تيليانين-7-غلوكورونيد في المرارة. 2d–gشكل) كما تم العثور على كمية صغيرة من كبريتات أكاسيتين في بيرفوسات المرارة ولكن تركيزاتها كانت أقل من  LLOQ من طريقة تحليل السائل عالي الضغط (0.2 ميكرومتر) وفي الوقت نفسه، لم يكن من الممكن الكشف عن كبريتات تيليانين في سائل الإرواء أو المرارة، كذلك يعد إمتصاص و اِسْتِقْلاب التيلانين في نموذج الجرذ المعوي ذي الأربع أماكن
تم تنشيط الأربع أجزاء من الأمعاء (الاِثْناعَشَرِيّ، الصائم العلوي،اللفائفي، والقولون) في وقت واحد بمعدل تدفق 0.168 مل / دقيقة باستخدام تيلانين.

استقرار التيلانين الأكاسيتين والغلوكورونيدس الخاص بهم
للتأكد من أن التحول الأحيائي للفلافونويدات لم يكن بسبب عدم الاستقرار الكيميائي ، وتم إجراء إختبار الإستقرار من التيلنين و الأكاسيتين و الغلوكورونيدس الخاص بهم في حل HBSS المرارة والبلازما
 وأظهرت النتائج أن الإستقرار في حل HBSS و المرارة عرض 90-110٪ من المستردات بعد التخزين في 1، 2، 3، و4h عند 37 درجة مئوية (الجدول S1 و S2 مواد الكلي الإلكترونية (ESM)).
وبالإضافة إلى ذلك فإن الإستقرار في بلازما الفئران أيضا ًعرض ما لا يقل عن 85٪ من المستردات بعد التخزين عند 25 درجة مئوية لمدة 4 ساعات -80 درجة مئوية لمدة 7 أيام تمر من خلال ثلاث دورات تجميد و إذابة
(-80 درجة مئوية و 25 درجة مئوية) و 10 درجة مئوية لمدة 12 ساعة (الجدول S3 في ESM).
هذه النتائج يمكن أن تقضي على إمكانية إن الفلافونويدات تخضع للتحلل المائي في " HBSS "buffer أو المرارة أو البلازما..
 
التحلل المائي للتيليانين و أكاسيتين غلوكورونيد بواسطة β-غلوكورونيداز
أجريت مجموعة متنوعة من الدراسات في المختبر للتحقيق إذا كان غلوكورونيدس  يخضع للتحلل في الدارئي المنقوع وأظهرت النتائج أن الجلوكورونيد أكاسيتين كان غير مستقرفي سائلُ الإِرْواء الفارغ
(الناتجة عن تنشيط HBSS buffer من خلال أربعة أجزاء من الأمعاء) (الشكل 3) ربما كان سببه β-غلوكورونيداز، لأن 0.1 ملي ساكارولاكتون (مثبط الجلوكورونيداز) خفضت بشكل كبير من تحلل غلوكورونيد أكاسيتين، في حين أن 4.4 ملي ساكارولاكتون ألغى تقريبا التحلل المائي بالكامل (الشكل 3)
وأكدت أهمية β-غلوكورونيداز أيضا ًمن خلال حقيقة أنه بعد الإجتماع مع β-غلوكورونيداز من الإشريكية القولونية، كانت منطقة الذروة لغلوكورونيد تيليانين و غلوكورونيد أكاسيتين قد إنخفضت بشكل ملحوظ في حين أن كان هناك زيادة نسبية في تيليانين و أكاسيتين (انظر الشكل S1 في ESM)

الشكل 5
وتم قياس آثار مثبط الليبوتروبين في طبقة خلية الجانجليون في الغشاء المخاطي وتراكم/تركيز بلازما تيليانين وايضه في نموذج للفئران تم ترويته دمويًا في الأمعاء مكون من أربعة مواقع باستخدام معدل تدفق 0.168 مل/دقيقة تم ترويته  التيليانين دمويًا...
آثار جلوكورونيداسي و/أو مثبطات طبقة خلية الجانجليون على إفراز أكاسيتين الجلوكويورنويد
نظراً لأن بالجلوكويورونويد أكاسيتين المستقلب الرئيسي التي تجتاز عملية الإفراز فإن قدرًا كبيرًا من الدراسة المتبقية تُركز على هذه الظواهر المقترنة.
أولاً  تم استخدام ساكتشارولاكتوني مثبط جلوكورونيداسي لتحول دون أن التحلل مركب أكاسيتين إلى أكاسيتين بغية تحديد مدى تأثير هذا التصرف مركب الجلوكويورونويد أكاسيتين. حيث إن إفراز مركب الجلوكويورونويد أكاسيتين في الأمعاء العليا (الشكل 6) والقولون (الشكل 7) انخفضت انخفاضا كبيرا في وجود مركب الساكتشارولاكتوني. و بعد ذلك مزيج من مركب  الجلوكورونيداسي ومثبط هرمون الساكتشارولاكتوني و هرمون الLPH المثبط للجلوكونولاكتوني و الذي كان قادرًا أيضًا على التقليل من إفراز الجلوكويورونويد أكاسيتين في الأمعاء العليا (الشكل 6) والقولون (الشكل 7)
 
الشكل 6
آثار ساكتشارولاكتوني المانع للساكتشارولاكتوني وحدها أو في تركيبة مع هرمون الLPH على إفراز بالجلوكويورونويد أكاسيتين في القولون. وتم قياس إفراز الجلوكويورونويد أكاسيتين في القولون في  نموذج محاكاة للأمعاء و التي تم ترويتها دمويًا باستخدام تدفق.
 
الشكل 7
آثار مثبط مركب الجلاكوروندايز وحده أو مخلوطًا بهرمون الLPH على إفراز الجلوكويورونويد أكاسيتين في الأمعاء العليا (صائم)،  حيث تم قياس إفراز بالجلوكويورونويد أكاسيتين في الأمعاء العليا في نموذج محاكاة للأمعاء التي تم ترويتها دمويًا.
 "إعادة التدوير الثلاثي" (أي إعادة التدوير المعوية الكبدية وإعادة التدوير المعوية ، وإعادة التدوير المحلية)
قد اجتاز نموذج مركب التيليانين عملية إعادة التدوير المعوية الكبدية والمعوية ، والمحلية ،  وتدعم مجموعة متنوعة من الدراسات في الموقع وفي المختبر تلك الادعاءات. و حينما تمت تروية مركب التيليانين دمويًا فقد اتضح أن تم إفراز كميات كبيرة من الأكاسيتين جلوكويورونيد و كميات قليلة من التيلينانين ومن أكاسيتين الجلوكويورونويد في الصفرا عن طرق الكبد (الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك ففي المختبر وفي حضانة مركبات مشتقة من البكتيريا β-لم يرافق مركب الجلوكورونيداسي مركب الأجليكونز  بشكل ملحوظ(الشكل. S1 باستخدام مجهر إلكتروني ماسح مما يشير إلى الدور الهام لإعادة التدوير المعوية الكبدية.
بعد perfused مع مثبط جلوكورونيداسي، المعوي إفراز بالجلوكويورونويد أكاسيتين في القولون (الشكل 7) انخفضت انخفاضا كبيرا، كما تشير إلى إعادة تدوير المعوي. 

الانتقال إلى مناقشة:


أظهرت نتائج هذه الدراسة للمرة الأولى أن الفلافونويدات، بما في ذلك فلافون الجلكوسيدز ، يمكن أن تخضع لخطة ثلاثية لإعادة تدوير حيث تحدث إعادة التدوير المعوية الكبدية وإعادة تدوير المعوية وإعادة التدوير المحلية في أن واحد (انظر الشكل 8). ويبدأ  عملية إعادة التدوير الثلاثية بالتحليل مائي لمركب للمحاكاة والتيليانين وأجليكوني وأكاسيتين و يحفزها هرمون الLPH  وعندما تتحلل تلك المركبات يتم امتصاص الأكاسيتين سريعاً في الخلايا الطلائية المعوية والانتقال في النهاية إلى خلايا الكبد. و يتم استقلاب الأكاسيتين سريعًا إلى جلوكورونيديس في خلايا الأمعاء وخلايا الكبد من خلال الاقتران الجلوكروني ثم يتم إفراز الجلوكونيديس سريعاً في التجويف أو الصفراء، يمكن أن تتحلل المركبات المترافقة مائيًا   مرةأخرى إلى أشكالها اللاسكرية باستخدام الجلوكورونيداسيس البكتيري في القولون أو الجلوكورونيداسيس المعوي في الأمعاء العليا. و يمكن أن يتم امتصاص الأجزاء اللاسكرية و الأكاسيتين التي نتجت لاحقًا في القولون (بالنسبة لإعادة التدوير المعوية الكبدية والمعوية) أو أي من خلايا الأمعاء مع مركب جلوكورونيداسيس المعوي (لإعادة التدوير المحلية)، والانتهاء من عملية إعادة التدوير. يمكننا وصف هذه الظاهرة بإعادة التدوير الثلاثية للدلالة على حقيقة أن مركب واحد (أكاسيتين في هذه الحالة) يمكن أن يخضع لهذه عمليات إعادة التدوير الثلاثة في وقت واحد
 
الشكل 8
التمثيل التخطيطي لإعادة التدوير الثلاثي من أكاسيتين باستخدام التيليانين كالمركب البدائي ومستقلب التيليانين [الرموز والاختصارات:/size]
T tilianin, TG′tilianin glucuronide, A acacetin, AG′ acacetin glucuronideولإثبات ما إذا كان لدينا نموذج لمركب التيليانين قد خضع لعملية إعادة تدوير معوية كبدية ومحلية فقد أجريت مجموعة متنوعة من التجارب في الموقع دراستنا الحالية. وقد افترضنا أن إعادة التدوير المعوية الكبدية المشاركة في سلوك  التيليانين مستقلباته ، بما في ذلك الحلامة (أي، أكاسيتين) تترافق(أي، بالجلوكويورونويد أكاسيتين). وعندما تمت ترويتها دمويًا مع التيليانين في الأمعاء ظهرت كميات كبيرة من أكاسيتين بالجلوكويورونويد وكميات صغيرة من أكاسيتين سرعة في الصفراء ، مما يشير إلى الامتصاص من القناة الهضمية (الشكل 2). عندما كانت عملية تروية التيليانين تتم باستمرار بلغ إفراز الصفراوية بالجلوكويورونويد أكاسيتين وأكاسيتين في ح 2 إلى أقصى حد (الشكل 2). بعد الحضانة مع مركب الجلوكورونيداسيس فإن البكتيريا القولونية كانت ترافق الجلوكويورونويد أكاسيتين في الصفراء لتكوين أكاسيتين  لاسكري(الشكل S1 في المجهر الإلكتروني الماسح) الذي أفاد أن الجلوكورونيديس يمكن أن يتحلل إلى مركبات لاسكرية بواسطة مركب الجلوكورونيداسيس البكتيري في القولون وإعادة الامتصاص في الخلية المعوية وبالتالي استكمال عمليات إعادة التدوير (أي إعادة التدوير الكبديةالمعوية). واتضح أن كميات كبيرة من الفلافونويدات ومستقلباتها، مثل أ بيوتشانين وجليسيتين وفورمونونيتين (9,13) قد تم إفرازها عن طريق الصفراء ومن ثم الوصول إلى القولون حيث يتم إعادة تحويلها إلى مركبات لاسكرية وإعادة  امتصاصها في الدم لاستكمال عملية إعادة التدوير الكبديةالمعوية
كما تعد إعادة تدوير المعوية للأكاسيتين ومركب الجلوكورونيديس ، حيث واكتشفنا إفراز معوي مفرط من رالجلوكويورونويد أكاسيتين (الشكل 2). ويمكن أن يتكون  الأكاسيتين سريعاً بعد التحلل من الجلوكورونيديس بواسطة البكتيريا المستمدة من النبات(الشكل رقم S1 في المجهر الإلكتروني الماسح) حيث إنه في حضور مثبط مركب الجلوكورونيداسي وحده قد انخفض الإفراز القولوني للجلوكويونويد أكاسيتين انخفاضًا كبيرًا ين بما يقرب من 80 ٪ (الشكل 6). وهذا يتسق مع المؤلفات السابقة أن جلوكورونيداسي لمنتجة من كميات كبيرة من البكتيريا في القولون يمكن أن ترافق الجلوكورنيداسيس  في المركبات اللاسكرية، وتمكنها من أن تكون إعادة امتصاصها في الأمعاء (4، 10). و بما أن عملية إعادة التدوير هي عملية ديناميكية فإن إيقاف أي تفاعل من التفاعلات سوف يؤثر بالسلب على العملية بأكملها مما يؤدي إلى انخفاض تدريجي في إعادة تدوير  ، فقد قمنا باستقراء أن تثبيط التحلل بالجلوكويورونويد أكاسيتين إلى أكاسيتين من خلال الجلوكونيونيداسيس المانع يمكنه إنقاص مقدار الكاسيتين في الخلايا المعوية مما يسبب كفاءة أقل وإفراز أقل للجلوكورونيديس أكاسيتين في التجويف. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن عددًا كبيرًا من الفلافونويدات بما في ذلك الفورمونونيتين (4)و الأبيجينين (7,24) و البرونتن (23)، و البيوشانين ألف (3)و الديدزين والجينيستين (7) خضعت لإعادة التدوير المعوية
بالإضافة إلى أننا قد أوضحنا أن أنشطة مركب الجلوكورونيداسي البكتيري في عملية الإرواء الدموية في الأمعاء العليا تمت بوساطة إعادة التدوير المعوية نظراً للأنشطة التي كانت أعلى في الأمعاء العليا مما في القولون (الشكل 3)والتي تمتلك أكبر قدر من البكتيريا وسط عمبلية الإرواء الدموية الفارغة والتي تم جمعها من مناطق مختلفة من الأمعاء (2) و نظرًا لأنه قد ينتج عن ذلك توليد لأقل من الأكاسيتين فيالخلايا المعوية وإفراز الجلوكويورونويد أكاسيتين فإنه عندما تمت ترويتها دمويًا مع مثبط الجلوكورونيداسي انخفض إفراز مركب الجلوكويورونويد أكاسيتين في الأمعاء العليا أيضًا بشكل ملحوظ بحوالي 50% (الشكل 7)مما يدعم يدعم فرضية وجود إعادة التدوير المحلية. وقد تم سابقا الإشارة إلى أن الجلوكورونيديس يمكن أن يتحلل بصرامة من  قبل مركب الجلوكورونيديس المستخرج من الخلايا المعوية لاستكمال إعادة التدوير المحلية. و قد تم استخدام مركبات الوجونين و الوجونوسيدي (الجلوكويورونويد ووجونين) (2) لإثبات وجود والدلالة على إعادة التدوير المحلية و إذا تم وضع هذه الاكتشافات الهامة معًا جنبًا إلى جنب فسوف تدعم افتراضنا بوجود ما يُسمى بإعادة التدوير الثلاثيةمما يعد اكتشافًا جديدًا حيث يوجد نقص في المؤلفات  مما يدل على وجود فلافونويد مشاركة في عملية إعادة التدوير المعوية الكبدية و المعوية في نفس الوقت.

إن العديد من مركبات الفلافونيد الموزعة على النباتات تكون بشكل عام من نوع فلافون الجلايكوسايد فتبدو عملية تكسير الغليكوزيل التى تطلق أجزاء لاسكرية خطوة أولية ضرورية في الإنفصال، حيث تعمل كبداية لكل عمليات الفصل التالية، أما عن التحليل المائي للتيلانين الذي يأتي عن طريق إنزيم الكوليسترول منخفض المستوى فهو الخطوة الأولية اللازمة لإستكمال عمليات إعادة التدوير الثلاث، إن الدليل الأقوى لدعم هذا الإفتراض هو أن إنزيم الكوليسترول منخفض المستوى يقلل من إمتصاص التيلانين و إستثناء أكاسيتين الغلوكورونيد من المرارة و سائل التروية بصورة تتناسب مع الجرعة، و هذا متوقع لكون تكسير الغليكوزيل الذي يسببه إنزيم الكوليسترول منخفض المستوى خطوة هامة في الإمتصاص و الأيض لمركبات الجلايكوسايد الفينولية الغذائية و التي تشمل أنواع الجلايكوسايد أحادية كجلايكوسايد الكيريستين و جلايكوسايد الجيليستين و جلايكوسايد الديدزاين، كما تشمل أنواع الجلايكوسايد الثنائية مثل الإيكارين و كلايكوسايد بيتا بايريدوكسين و جلايكوسايد الريزفيراتول، بالإضافة إلى الجلايكوسايد الثلاثي كإبميدين بي و إبميدين سي، تتحلل الطبقات السفلية لإنزيم الكوليسترول منخفض المستوى مائيا ً لأجزاء لاسكرية ثم تمتصها الخلايا المعوية ثم تتحول سريعا ً إلى جولوكوز في القناة الهضمية، تخرج إنزيمات تطلقها المرارة أو الأمعاء أثناء العملية الغذائية و تتحل هذه الإنزيمات مائيا ً لأجزاءلاسكرية و تعيد الأمعاء إمتصاصها منهية ً عدة عمليات لأعادة التدوير و هم إعادة التدوير الكبدية و إعادة التدوير المعوية و إعادة التديرو الإعتيادية، و على صعيد أخر يمكن تحليل بعض أنواع فلافون الجلايكوسايد مائيا ً و التي يمكن أن تكون الطبقة السفلى لإنزيم الكلسترول منخفض الستوى مثل الروتين و البوهوسايد و هذا عن طريق جلايكوسايد بكتيرية في القولون أو ممتصة من الأمعاء مباشرة ً، و لا يعد إنزيم الكوريسترول منخفض المستوى عنصرا ً مساهما ً في هذه الجلايكوسايد و يعتبر فصلهم مختلفا ً إلى حدٍ ما.
 
أشارت الدراسات الحديثة أن لإنزيم غلوكورونيداز و إنزيم الكوليسترول منخفض المستوى تأثيرات مختلفة و واضحة على الإنزيمات و التي يمكن أن تؤدي إلى انخفاض معدل إفراز أكاسيتين الغلوكورونيد، فحين يُستخدم الإنزيمان فى آن واحد لا تختلف كمية أكايستين الغلوكورونيد المُفرزة، و إن أغلب الشك في أن تركيز الأكايستين داخل الخلايا يقل بسبب كبت الإنزيمين فيظل تدفق الناقل خطوة محدودة القياس، و على صعيد آخر يستمر المعدل المنخفض من الغلوكورونيداز في إفراز كميات مناسبة من الغلوكورونيد للتدفق، و بهذا لا يؤي استخدام الإنزيمين في آن واحد إلى تقليل إفراز الغلوكورونيد مقارنة ً باستخدام كل مركب على حدى.
 
علاوة على ذلك كان الإفتراض الأكبر أن كبت الجلايكوسايد المحلل مائيا ً يمكن أن يزيد من التراكم داخل المعدة و إفرازات المرارة لفلافون الجلايكوسايد مثل التيلانين على الرغم من أن تقليل إنزيم الكوليستيرول منخفض المستوى للتيلانين الذي تفرزه المرارة بالإضافة إلى غلوكورونيد المركب ذاته لهو ملاحظة غير متوقعه، و لتبرير هذا الإختلاف غير المتوقع تم تحديد تراكم هذه العناصر داخل الغشاء المخاطي للأمعاء و البلازما و كانت المفاجأة أن تراكم التيلانين في البلازما و الغشاء المخاطي تزايد في وجود الجلوكونولاكتون، تبدو أسباب هذه الظاهة غير واضحة و لكن تستمر الدراسات حتى الآن لتحديد ميكانيكية إمتصاص الكبد للإنزيم.
 
إن عمليات التدوير الثلاث _ الكبدية و المعوية و الإعتيادية_ للفينول لها تأثير عميق على فصله في الأمعاء  الكبد نتيجة ً لنزوعه إلى تحمل عمليات إعادة التدوير متكررة خلال النظام الهضمي، يُظهر الفيول و الذي يشمل الفلافونيد الدورات القصيرة للبلازما الظاهرة و لكن أطول قليلا ً من المتوقع من خلال إفتراضات نظامهم البيولوجي القصير و بذلك يمكن أن تساهم أنصاف الحيوات الطويلة في عقارات الفلافونيد نتيجة لإمكانية تحويل غلوكورونيد الفلافونيد إلى عناصر لا سكرية نشطة عن طريق الغلوكورونيداز الموجود بالأمعاء و القولون، فكما هو مُلاحظ تعد كل عملية تدوير ضرورية فعلى سبيل المثال حيث تصل الأجزاء اللاسكرية إلى أعلى تركيز لها تقوم عملية التدوير الكبدية بدور هام في فصله، يرجع هذا إلى إمكانية امتصاصه السريع أثناء التشبع في العملية الغذائية بالقناة الهضمية ثم يستقر في الأغلب بالكبد، يتبع ذلك إفراز الغلوكورونايدعن طريق المرارة و على النقيض يمكن أن يُمتص الجزء اللاسكري منخفض التركيز ثم يستقر في القناة الهضمية نتيجة للتركيز المرتفع للجزء اللاسكري داخل الخلية المعوية عنه في الوريد البابي، و يمكن تحليل الغلوكورونيد المنبثق مائيا ً ليعود مرة أخري إلى جزء لاسكري مما يتبعه التدوير المعوي و الإعتيادي بدون أى تدخل من التدوير الكبدي، على صعيد أخر فإن في حالة الفينول الذي يكون الغلوكورونيد خاصته أكثر نشاطا ً بيولوجيا ً أمثال الإزيتيمايب و البروفين تنتج العمليات الثلاث مجتمعات إلى مدة أطول للنظام الدوري و العديد من النشاطات العلاجية المحتملة، أما في حالة الفينول الذي يكون الغلوكورونيد خاصته أقل نشاطا ً بيولوجيا ً مثل الرالوكسفين فيعني وجود العمليات الثلاث وجود أنصاف حيوات أطول و ربما فترة طويلةمن التفاعل حيث يمكن أن يتحول المصل إلى جزء لاسكري داخل الكائن الحي.
 
تدعم الأدلة إفتراضية أن التيلانين و هو نوع من الجلايكوسايد يمكنه أن يشارك بطريقة مباشرة أو غير مباشرة في عدة عمليات تدوير، و على الرغم من كون كمية صغيرة من الفيلانين قادرة على البقاء في القناة الهضمية دون تغيير بعد إفرازها إلا أنه لا نية لتصديق أن التيلانين و غيره من فيلانين الجلايكوسايد يشاركون في التدوير بطريقة مباشرة عن طريق أجزائهم اللاسكرية المماثلة و بالحديث عن التيلانين فإنه الأكايستين، يستخدم التيلانين بدلا ًمن الأكايستين في داسة التروية بسبب أفضليته في الذوبان المائي، فالذوبان الجيد يمكن الباحثين من إجراء دراسات إضافية خلال تكريز أعلى (يصل إلى 5 و 40 ميكرومترمن التيلانين)، أُختير التركيز الأعلى بنسبة 40 ميكرومتر نتيجة لحاجة ضبط و قياس غلوكورونيد التيلانين و الذي كان صعبا ً بسبب بطء معدل تحويل التيلانين إلى غلوكورونيد، أشارت الداسة الحركية أيضا ً أن 40 ميكرومتر هو قياسا ً مناسبا ً للتركيز المُستخدم في عملية التروية، فيعد ضبط و قياس غلوكورونيد التيلانين هاما ً للغاية بسبب إكتشافه كمركب حديث فلم يُذكر عنه شيء في الأدب العلمي.
 
ختاما ً، قامت الداسات بتقديم وصف لإحتمالية وجود أنظم تدوير معوية و كبدية و إعتيادية للجزء اللاسكري و هو الأكايستين، تظهر حقيقة أن جلايكوسايد التيلانين الذي يمكنه التحلل مائيا بطريقة سريعة عن طريق إنزيم الكوليستيرول منخفض المستوى الذي تفرزه المعدة لأفراز الأكايستين ثم مشاركته في عمليات التدوير الثلاث تظهر أن العديد من الفينولات الطبيعية يمكنها أن تحمل خاصية الفصل نفسها، أما عن الفينول و الذي يشمل عقارات أمثال إزيتيمايب و المورفين و الرالوكسيفين فيُمكن العمليات الثلاث من إطالة أنصاف حيوات البلازما و زيادة نشاطهم البيولوجي المعوي و الذي بدوره يمكن أن يكون هاما ً في صناعة عقارات أمثال إيزيتيمايب الذي يكون الغلوكوروفيند خاصته أكثر نشاطا ً في العضو المستهدف و هو القناة الهضمية، يمكن أن تساعد دراسات إضافية تعي بأهمية و توسيع مجال تطبيق ميكانيكية العمليات الثلاث في توضيح أهمية التدوير للتحقق منما إذا كان المكب سيخضع للعمليات الثلاث أم لا.